キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

当院では、このプロトコルのレビューは必要ありません。市の希望病理部がコーディングされてから破棄された新鮮な膠芽腫腫瘍サンプルをいただいて、私たちの研究室は、キーへのアクセスを得ることができません。識別データのない、生検・切除の時に前の治療や病気の状態にのみデータを標本をいただいています。 1. メディアの準備 主な糸球体基底膜の細胞を培養するため神経幹細胞メディアの準備: DMEM:F12、1:50 B27、5 μ g/mL ヘパリンと 2 ミリ モル/L L-グルタミン;週 2 回 20 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) と 20 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子 (FGF) 補われる (材料の表を参照してください)。 T 細胞のメディアの準備: 10% 牛胎児血清 (FCS); を含む X VIVO 15(材料の表を参照してください) すべての 48 h 70 IU/mL 以上より 2 と 0.5 ng/mL 以上より 15 を補充しました。 共培養メディアを準備: EGF と FGF のサプリメントなしメディアを神経幹細胞を取り出して、10% の FCS を追加。 染色液 (FSS) FACS を準備: HBSS の 2% の FCS ナン3 (0.5 g/500 mL)。 2. GBM の腫瘍細胞の調製 4 分の 300 × gで遠心分離によって低通過 GBM の腫瘍球 (TSs) を収穫し、上澄みを廃棄します。注:神経幹細胞メディア、37 ° C で 5% CO2インキュベーター22,23,24を前述のように腫瘍を切除され、GBM の腫瘍から生成される球体 (TSs) あらかじめ 37 ° C の水浴の共培養メディアを温めます。 GBM TSs に冷たい accutase の 1 つの mL を追加、30-60 秒のピペッティングによる TSs を切り離して考えるし、暖かい共同培地 5 mL を追加することで解離を停止します。注:5 分以上 accutase 上 GBM TSs に保持されませんする必要があります。 4 分の 300 × gで遠心分離によって糸球体基底膜の細胞を採取、培養上清を破棄し、2 mL の共培養培地で細胞を再懸濁します。 細胞生存率のカウンターを使用してセルの濃度を決定します。注:セル実行可能性がある必要があります > 70%。 3. 車 T 細胞の作製 試金、前に 24 h 未満流れ cytometry チューブに車 T 細胞の 100 μ L を取るし、FSS の 2 mL を加えます。注:車 T 細胞は11,21を前述のように生成され、T 細胞培地で培養しました。 4 分及び破棄上澄みの 300 x gで遠心分離します。 洗浄セル、300 x gで 4 分間遠心する FSS の 2 mL を追加し、上澄みを廃棄します。 4 ° c 30 分車式を示す適切な抗体で細胞を染色します。注:たとえば、IL13Rα2 ターゲットの車が記載されている場合以前25 , アンチ IL13 抗体で染色し、. FSS の 2 mL で 2 回洗浄し、フローサイト車 exn を分析します。 図 1Bに示すようにゲートの戦略を使用して T 細胞に車 % を決定します。 共培養の日 4 分の 300 × gで遠心分離によってすべての車 T 細胞を収穫、上清を捨てる、2 mL の共培養培地で細胞を再懸濁します。 細胞生存率のカウンターを使用してセルの濃度を決定します。注:セル実行可能性がある必要があります > 70%。 4. 腫瘍を設定-T 細胞共培養 腫瘍細胞共培養メディアで 16 万/mL の濃度に希釈します。 車 % に基づいて、車 T 細胞共培養メディア 4 万の車+細胞/mL の濃度に希釈します。注:たとえば、車は 50%、T 細胞濃度が 40 万/mL 4 万車+細胞/mL の最終的な集中を取得する 1:5 希釈を行います。 96 ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに 100 μ L の希釈した腫瘍細胞のピペットします。 腫瘍細胞とのミックスを含むを各ウェルに 100 μ L の希釈車 T 細胞のピペットします。注:4 の時点で各腫瘍 T 細胞共培養を分析します。たびに異なる分析に基づいてポイント 4-6 レプリケートが必要と可能性がありますが、< 時間ポイントごと 3 複製はお勧めできません。代表的な platemap の表 1を参照してください。 37 ° C、5% CO2インキュベーターでプレートを維持します。 5. 腫瘍細胞の再投与 注:2、4、6 日後初期培養セットアップ (図 1A) での再投与が行われます。 収穫し、(手順 2.1 2.6) 上記のように GBM TSs を切り離して考えます。 64 万/mL の濃度で GBM 細胞を再懸濁します。 再投与を必要とする共培養井戸を決定する (表 1参照)、各ウェルの上から 50 μ L メディアを慎重に取り外します。 各ウェルに GBM 細胞懸濁液 50 μ L を追加し、ミックスも、プレートを 37 ° C、5% CO2インキュベーターに戻します。 6. サンプルの収穫し、フローサイトメトリー法による解析 注:サンプルは、1、2、3、4 で、初期培養セットアップ ラウンド腫瘍の挑戦、それぞれ 1、3、5、7 日後に収穫されます。 事前洗浄器 37 ° C で 0.05% トリプシン EDTA 溶液を温めます。 井戸および収穫を必要とする新しい丸底 96 ウェル プレートにメディアを転送を決定します。 37 ° C、5 分で残りの腫瘍細胞を消化する井戸にトリプシン-EDTA の 50 μ L をピペットします。 顕微鏡で細胞を底からデタッチを確認します。 剥離細胞を再懸濁しますトリプシン-EDTA の丸底 96 ウェル プレート対応する井戸に戸建のセルを含むを転送しても下周りのピペットします。 遠心分離機 300 × g、4 分の 4 ° C で丸底の 96 ウェル プレート、上澄みを廃棄します。 200 μ L/ウェルの細胞, 300 × gで遠心分離, 4 ° C、4 分を洗浄する FSS を追加し、上清を捨てます。 100 μ L/ウェル FSS 含む抗体 (材料の表を参照してください)、細胞を再懸濁し、4 ° C、30 分で細胞の汚れ。 300 × g、4 分の 4 ° C で遠心し、破棄上清、セルを 100 μ L/ウェル FSS を追加します。 200 μ L/ウェルの細胞, 300 × gで遠心分離, 4 ° C、4 分を洗浄する FSS を追加し、上清を捨てます。 500 ng/ml の DAPI、FSS の 100-200 μ L/ウェルの細胞を再懸濁します、フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。 7. 機能とフェン Otypic 車 T 細胞解析 流れの cytometer からデータ ファイルを取得し、すべてライブ (DAPI) 細胞 (図 1C) をゲートします。 ゲート、CD45 による腫瘍細胞を定量化する-の人口とゲート、CD45 による車 T 細胞+車 + 人口 (図 1C)。注:場合は腫瘍細胞は CD45 表現 (例えばらじおリンパ腫細胞) の腫瘍細胞から T 細胞を区別するために使用することができます抗 CD3 染色します。 腫瘍細胞と車 T 細胞数時間コースをプロットします。 4-1 bb と CD69 の共発現による T 細胞の活性化を識別します。注:これらの表面のマーカーは、T 細胞活性化 6 24 h ポスト初期培養を分析する使用できます。 ティム 3、ラグ 3 PD 1 の式によって T 細胞の枯渇を識別します。 CD45RO と CD62L の式によって T 細胞メモリ ステータスを識別します。