ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

IRB שלנו אינו דורש סקירה של פרוטוקול זה. אנחנו מקבלים דגימות גידול גליובלסטומה טריים שהושלכו עיר של תקווה המחלקה לפתולוגיה שנכתבו, המעבדה שלנו אין אפשרות לקבל גישה למפתח. אנו מקבלים את דגימות עם נתונים רק על מצב המחלה וטיפול מראש ביצוע ביופסיה/כריתה, בלי נתונים מזהים. 1. הכנה מדיה להתכונן culturing ראשי שורות תאים GBM תאי גזע עצביים מדיה: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 הפארין µg/mL, ו 2 mmol/L-גלוטמין; בתוספת 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ואת ng/mL 20 בסיסי פיברובלסט גורם גידול (FGF) פעמיים בשבוע (ראה טבלה של חומרים). הכינו את תא T מדיה: 15 X-VIVO המכיל 10% עגל עוברית סרום (FCS); מצורפים עם 70 IU/mL rhIL-2 ו- 0.5 ng/mL 15-rhIL כל 48 שעות (ראה טבלה של חומרים). להכין תרבות שיתוף מדיה: לקחת תאי גזע עצביים מדיה ללא תוספת EGF ו- FGF, ולהוסיף 10% FCS. להכין FACS מכתים פתרון (FSS): HBSS, 2% FCS, נאן3 (0.5 ג’י של 500 מ”ל). 2. הכנת תאים סרטניים GBM הקציר נמוך-המעבר GBM הגידול הספירות (TSs) על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 4 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.הערה: הגידול GBM הספירות (TSs) מופקים מן resected גידולים כפי שתואר לעיל22,23,24, ומתוחזק בתקשורת תאי גזע עצביים, בחממות עם 5% CO2 ב 37 º C. לחמם תרבות שיתוף מדיה באמבט מים 37 º C. להוסיף 1 מ”ל של accutase קר GBM TSs, מביצועם TSs מאת pipetting עבור s 30-60, וכן להפסיק דיסוציאציה על-ידי הוספת 5 מיליליטר חמים תרבות שיתוף מדיה.הערה: GBM TSs לא צריך להישמר על accutase עבור יותר מ 5 דקות. קציר תאים GBM על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 2 מ”ל של תרבות שיתוף מדיה. לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הכדאיות התא.הערה: תא הכדאיות בטח > 70%. 3. הכנת רכב T תאים פחות מ- 24 שעות לפני וזמינותו, לקחת 100 µL בתרבית תאים T המכונית לתוך צינור cytometry זרימה ולהוסיף 2 מ של FSS.הערה: תאי T המכונית היו שנוצר כפי שתואר לעיל11,21 ותרבותית בתקשורת תא T. צנטריפוגה ב x 300 גרם 4 דקות ו להשליך תגובת שיקוע. 2 מ של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, להוסיף ולמחוק את תגובת שיקוע. כתם התאים עם נוגדן המתאים כדי לציין ביטוי המכונית ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.הערה: לדוגמה, אם מכונית, ממוקדות IL13Rα2 תיאר בעבר25 משמש, ואז כתם עם נוגדן anti-IL13. לשטוף פעמיים עם 2 מ של FSS וניתוח exn המכונית באמצעות cytometer של זרימה. לקבוע את המכונית % בתאי T באמצעות האסטרטגיה המגביל שמוצג באיור 1ב’. ביום של תרבות משותפת, לקצור את כל המכונית T תאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 2 מ”ל של תרבות שיתוף מדיה. לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הכדאיות התא.הערה: תא הכדאיות בטח > 70%. 4. הגדרת הגידול – תרבות משותפת תא T לדלל תאים סרטניים כדי ריכוז של 0.16 מיליון למ”ל עם תרבות שיתוף מדיה. בהתבסס על המכונית %, לדלל בתאי T רכב על ריכוז של 0.04 מיליון מכוניות+ תאים/mL עם תרבות שיתוף מדיה.הערה: לדוגמה, אם המכונית היא 50% והוא תא T ריכוז 0.4 מיליון למ”ל, ואז לגרום לדילול 1:5 כדי לקבל את הריכוז הסופי של 0.04 מיליון מכוניות+ תאים/מ ל…. פיפטה 100 µL של תאים סרטניים מדולל לתוך כל טוב של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה. פיפטה 100 µL של תאי T המכונית מדולל לבאר כל המכילה תאים סרטניים, לערבב היטב.הערה: כל תרבות משותפת תא הגידול-T ינותחו בנקודות זמן 4. 4-6 משכפל ייתכן שיהיה צורך בכל פעם נקודת מבוסס על ניתוח שונות, אבל < 3 משכפל לכל נקודת זמן לא מומלץ; ראה טבלה 1 platemap נציג. לשמור על הצלחת ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. 5. גידול התא Rechallenge הערה: Rechallenge מתקיים ב- 2, 4, 6 ימים שלאחר ההתקנה הראשונית תרבות משותפת (איור 1א’). הקציר, מביצועם GBM TSs כמתואר לעיל (שלבים 2.1-2.6). Resuspend תאים GBM-ריכוז של 0.64 מיליון למ”ל. לקבוע הבארות תרבות משותפת צריך rechallenge (ראה טבלה 1) בזהירות להסיר מדיה µL 50 מהחלק העליון של כל טוב. להוסיף 50 µL של השעיה תאים GBM לבאר כל, מערבבים היטב ולאחר מכן תחזיר את הצלחת לתוך 37 ° C, 5% CO2 מיכלים. 6. הקציר דגימות וזרימה ניתוח Cytometric הערה: דוגמאות יהיה לקצור בעמדה 1, 3, 5, 7 ימים שההתקנה הראשונית תרבות משותפת, עם 1, 2, 3 ו- 4 סיבובים של הגידול אתגר, בהתאמה. לחמם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA waterbath 37 º C. לקבוע את הבארות צריך קציר ולא להעביר את המדיה לתוך צלחת חדשה של 96-ובכן סיבוב המדרגה. פיפטה µL 50 של טריפסין-EDTA לתוך הבארות לעכל תאים סרטניים שנותרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. תחת מיקרוסקופ, אשר שהתאים יש תלושים מלמטה. פיפטה סביב החלק התחתון טוב resuspend תאים מנותק ולאחר מכן להעביר טריפסין-EDTA המכיל תאים מנותקת הבארות המקביל של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון. צנטריפוגה צלחת 96-ובכן עגול-התחתון ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואז למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 200 µL/טוב של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 100 µL/טוב FSS המכיל נוגדנים (ראה טבלה של חומרים), הכתם תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להוסיף µL 100/FSS טוב לתאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואז להשליך תגובת שיקוע. להוסיף 200 µL/טוב של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים עם 100-200 µL/טוב של FSS עם 500 ננוגרם למ”ל דאפי, ולאחר מכן לנתח דגימות ידי cytometry זרימה. 7. פונקציונלי וניתוח פן Otypic של תאי T המכונית לאחזר את קבצי הנתונים זרימה cytometer, שער כל (דאפי-) תאים חיים (איור 1C). לכמת תאים סרטניים על ידי gating CD45 את– האוכלוסייה ותאי T המכונית על ידי gating את CD45+, רכב + האוכלוסייה (איור 1C).הערה: אם תאים סרטניים אקספרס CD45 (למשל ראג’י תאים לימפומה), אנטי-CD3 מכתים יכול לשמש כדי להבדיל בין תאי T מתאי הגידול. מגרש תא הגידול ומספר תא T המכונית במהלך הזמן. לזהות תא T ההפעלה על-ידי הביטוי משותף של 4-1BB, CD69.הערה: סמנים אלה פני השטח ניתן לנתח תא T הפעלה 6-24 h פוסט משותף התרבות הראשונית. לזהות תא T מיצוי על ידי הביטוי של PD-1, לג-3 וטים-3. מזהים תא T זיכרון מצב על-ידי הביטוי של CD45RO ושל CD62L.