Her presenterer vi for å undersøke svekkelse av nevrovaskulære under eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus i vivo. Vi adresse spesielt hvordan du fastslår blod – hjerne barrieren permeabilitet og gelatinase aktivitet involvert i leukocytter migrasjon over glia-limitans.
Nevrovaskulære enheten (NVU) består av mikrovaskulær endotelceller danner blod – hjerne barrieren (BBB), en endothelial kjelleren membran med innebygd pericytes, og glia limitans består av parenchymal kjelleren membranen og astrocytic slutten-feed omfavner abluminal aspekt av sentralnervesystemet (CNS) microvessels. Tillegg til å opprettholde CNS styrer homeostase NVU immun celle menneskehandel i CNS. Under immunosurveillance av CNS kan lave antall aktivert lymfocytter krysse endothelial barrieren uten å forårsake BBB dysfunksjon eller kliniske sykdommen. Derimot under neuroinflammation som multippel sklerose eller dyr modell kan eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE) et stort antall immunceller krysse BBB og senere glia limitans eventuelt nå CNS parenchyma fører til kliniske sykdommen. Immun celle migrasjon i CNS parenchyma er en prosess som involverer en sekvensiell overføring over endothelial og glial barrieren for NVU ansette distinkte molekylære mekanismer. Hvis etter deres passasje over endothelial barrieren, T celler møte deres beslektet antigen på perivascular antigen presentere celler deres lokale reaktivering starte etterfølgende mekanismer fører til fokal aktivering av gelatinases, som gjør de T-cellene til å krysse glial barrieren og angi CNS parenchyma. Derfor kan vurdere både BBB permeabilitet og MMP aktivitet i romlig sammenheng med immun celle akkumulering i CNS under EAE angi tap av integriteten til endotelial og glial barrierer av NVU. Her viser vi hvordan å indusere EAE i C57BL/6 mus av aktiv immunisering og deretter analysere BBB permeabilitet i vivo bruke en kombinasjon av eksogene fluorescerende tracers. Vi ytterligere vise, hvordan å visualisere og lokalisere gelatinase aktivitet i EAE hjernen av i situ zymogaphy koblet til immunofluorescent stainings av BBB kjelleren membraner og CD45 + invaderende immunceller.
Sentralnervesystemet (CNS) koordinerer alle kropp og mentale funksjoner i virveldyr CNS homeostase er avgjørende for riktig kommunikasjon av neurons. CNS homeostase er garantert av nevrovaskulære enhet (NVU), som beskytter CNS fra blodet endring miljøet. NVU består av CNS mikrovaskulær endotelceller, som er biokjemisk unike og etablere blod – hjerne barrieren (BBB) i kontinuerlig crosstalk med pericytes, astrocyttene, nerveceller og ekstracellulær matrix (EFM) komponenter, etablere to forskjellige kjelleren membraner1. Endothelial kjelleren membranen som ensheathes abluminal aspekt av BBB endotelceller havner mange pericytes og består av laminin α4 og laminin α5, i tillegg til andre ECM proteiner2. Derimot parenchymal kjelleren membranen består av laminin α1 og laminin α2 og blir omfavnet av astrocytic slutten-fot. Den parenchymal kjelleren membranen med astrocytter slutten-føttene komponerer den glia limitans som segregerer CNS neuronal nettverket fra Cerebrospinalvæske fylt perivascular eller subarachnoid mellomrom3. På grunn av den unike arkitekturen i NVU er immun celle menneskehandel i CNS forskjellig fra at i perifere vev som det krever en prosess med immunceller, første brudd endothelial BBB og senere glia limitans for å nå CNS parenchyma.
Multippel sklerose (MS) er en vanlig neuroinflammatory sykdom i CNS, der et stort antall sirkulerende immunceller angi CNS og forårsake neuroinflammation, demyelinisering og fokal tap av BBB integritet4. Tap av BBB integritet er en tidlig kjennetegner MS, som indikert av tilstedeværelsen av gadolinium motsetning styrke lesjoner i CNS som visualisert av magnetisk resonans imaging (MRI)5. Leukocytter bloduttredelse til CNS oppstår på nivået av postcapillary venules; men gjenstår nøyaktig mekanismer involvert i immun celle diapedesis over BBB kjelleren membranen og glial barrieren å bli utforsket. Eksperimentell autoimmune immunsviktvirus (EAE) fungerer som en dyremodell for MS og har bidratt betydelig til vår nåværende kunnskap om MS patogenesen. For eksempel har bruker EAE modellen det blitt oppdaget at leukocytter bloduttredelse oppstår i en må prosess, inkludert en første fangst og rullende steg formidlet av selectins og mucin-lignende molekyler som P-selectin glykoprotein ligand (PSGL) -1, etterfulgt av integrin-avhengige fast arrestasjon og gjennomgang av T-celler på BBB endotelceller ettergivende sidene i diapedesis6.
Når T celler har krysset endothelial BBB og endothelial kjelleren membranen, trenger de å møte deres beslektet antigen på makrofager eller dendrittiske celler strategisk lokalisert i leptomeningeal eller perivascular mellomrommene. Dette samspillet induserer fokal produksjon av pro-inflammatoriske mediatorer den utløseren ytterligere mekanismer kreves for CNS vev invasjonen av immunceller via glia limitans7,8,9. Fokal aktivering av matrix-metalloproteinases (MMP) -2 og MMP-9 endrer chemokine aktivisering og induserer nedbrytning av ekstracellulær matrix reseptorer på astrocytter slutten-fot, som er en forutsetning for immun celle migrasjon over den glia limitans i den CNS parenchyma og å indusere utbruddet av kliniske symptomer EAE10,11.
Kombinere påvisning av CNS infiltrere immun celle med BBB gir lekkasje og gelatinase aktivitet i CNS vev delene verdifull informasjon om funksjonelle integriteten av endothelial og glial barrieren i sammenheng med neuroinflammation. For eksempel, vi nylig undersøkt konstituerende tap av endothelial tett krysset molekyl junctional vedheft molekyl (SYLTETØY)-B i immun celle menneskehandel i CNS i sammenheng med EAE. Sammenlignet med sunn vill-type C57BL/6 mus, sunn JAM-B-mangelfull littermates viste ingen nedskrivning av BBB integritet som vist i vivo permeabilitet vurdering ved hjelp av endogene samt eksogene tracers12. I forbindelse med EAE, JAM-B-mangelfull C57BL/6 mus viste ameliorated sykdomssymptomer, som var forbundet med inflammatorisk celle overlapping i leptomeningeal og perivascular mellomrom12. Undersøke fenomenet vi brukt i situ zymography, slik at ID gelatinase aktivitet for å teste om mangelen på gelatinase aktivitet i JAM-B-mangelfull mus kan være ansvarlig for redusert antall immunceller klarte å bryte den glia limitans12.
Ettersom finnes endret ulike genetisk musen modeller mangler, f.eks forskjellige BBB tett krysset molekyler som kan forårsake endringer i BBB funksjon, metoder for å undersøke BBB integritet er viktig. I tillegg kan nyutviklet narkotika påvirke NVU barrierer. Her viser vi hvordan å indusere EAE i C57BL/6 mus av aktiv immunisering med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i fullstendig Freund adjuvans. Deretter forklarer vi hvordan å lokalisere immun celle infiltrasjon over endothelial og glial barrierer av NVU og studien i vivo endothelial og glial barriere integritet i situ påvisning av eksogene tracers og gelatinase aktivitet, henholdsvis.
Her presenterer vi en protokoll for å indusere og overvåke EAE i kvinnelige C57BL/6 mus. Kvinner er preferentially valgt, og det er en forekomst av kvinner: menn 3:1 i MS. For å vurdere alvorlighetsgraden av EAE, vi gjort bruk av et 3-punkts scoring ark. EAE alvorlighetsgraden er generelt scoret med hensyn til alvorlighetsgraden av motor dysfunksjoner. Mus med avanserte stadier av EAE, dvs viser en score over 2 skal bli ofret for å unngå unødvendig lidelse av dyrene. Derfor er det anbefalt å score mus med like int…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig Lydia Sorokin, som delte hennes opprinnelige i situ zymography protokollen10 med oss.
AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |