שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans
Summary
שחייה המושרה assay התנהגותית ומבוססת חקר המנגנונים המשמשת כבסיס של דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא שיתוק (SWIP). עם זאת, שיטה מפורטת כדי לבצע את הבדיקה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור SWIP.
Abstract
וזמינותו שחייה שמתואר פרוטוקול זה הוא כלי תקף כדי לזהות חלבונים ויסות של דופאמין synapses. בדומה יונקים, דופמין (DA) קובע מספר פונקציות ב- C. elegans כולל למידה ופעילות מוטורית. תנאי זה לעורר שחרור דא (למשל, אמפטמין (AMPH) טיפולים) או זה למנוע DA סיווג (למשל, חיות חסר המשגר DA (dat-1) אשר אינם מסוגלים reaccumulating DA לתוך הנוירונים) ליצור עודף של DA חוץ-תאית בסופו של דבר וכתוצאה מכך ומכניקה עכבות. תופעה זו בולטת במיוחד כאשר בעלי החיים לשחות במים. למעשה, בעוד חיות פראי-סוג להמשיך לשחות לתקופה ממושכת, מוטציות null dat-1 ופראי-סוג שטופלו AMPH או מעכבים של המשגר DA לשקוע לתחתית הבאר ואל תזוז. תופעה זו נקראת “שחייה המושרה שיתוק” (SWIP). למרות וזמינותו SWIP וותיקה, תיאור מפורט של השיטה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע SWIP. כדי לבצע את הבדיקה, מאחר חיות הבמה-4 דרגות זחל מוצבים צלחת זכוכית ספוט המכיל סוכרוז פתרון בקרת עם או בלי AMPH. בעלי חיים הם הבקיע עבור התנהגותם שחייה באופן ידני על-ידי ויזואליזציה תחת סטריאוסקופ או באופן אוטומטי על ידי הקלטה עם מצלמה רכוב על סטריאוסקופ. קטעי וידאו הם מכן נותחו באמצעות תוכנת מעקב, אשר מניב ייצוג חזותי של תדירות בהלקאה ושיתוק בצורה של מפות חום. שתי המערכות ידניים ואוטומטיים מבטיח של הבדיקה לכימות בקלות של יכולת שחייה החיה, ובכך להקל על הקרנה עבור חיות הנושאת מוטציות בתוך מערכת וכולינרגיים או גנים עזר. בנוסף, ניתן להשתמש SWIP כדי להבהיר את מנגנון הפעולה של תרופות של התעללות כגון AMPH.
Introduction
חיות לבצע מגוון רחב של התנהגויות מולדת ומורכבים מתווכת על ידי נוירוטרנסמיטרים שונים מתואמת על ידי תהליכים מסובכים איתות. הנוירוטרנסמיטר דופמין (DA) שמתווכת התנהגויות שנשמרת מאוד על פני מינים, כולל למידה, המוטורית ועיבוד גמול.
נמטודות קרקע C. elegans, עם מערכת עצבים פשוטה יחסית וממופים היטב המורכב הנוירונים רק 302, מראה התנהגויות מורכבות בצורה ניכרת, כולל רבים שמווסתים על-ידי DA כגון ההזדווגות, למידה, שיחור מזון, גפיים, הנחת הביצה 1. בין תכונות אחרות, מחזור חיים קצר, קלות הטיפול ושימור של מולקולות איתות, להדגיש יתרונות השימוש C. elegans כמודל ללימוד הבסיס העצבי של התנהגויות ההכפלה.
ההרמפרודיט C. elegans מכיל נוירונים דופאמין שמונה; בנוסף לכך, הזכר מכיל שישה זוגות נוספים להזדווגות למטרות. כמו יונקים, הנוירונים הללו לסנתז DA ולבטא את המשגר DA (DAT-1), חלבון ממברנה נמצאו אך ורק בנוירונים דופאמין, אשר מסיע DA שפורסם החריץ הסינפטית בחזרה לתוך הנוירונים דופאמין. יתר על כן, רוב החלבונים המעורבים בכל שלב של סינתזה, אריזה ועל שחרור דא מאוד נשמרים בין תולעים ובני ו, כמו אצל יונקים, DA ממיקרו התנהגויות האכלה ובאופן C. elegans2.
C. elegans זוחל על משטחים מוצקים, שוחה עם התנהגות אופיינית בהלקאה במים. מעניין, מוטציות חסר הבעה של DAT-1 (dat-1) לזחול בדרך כלל על משטח מוצק אבל להיכשל לקיים את השחייה כאשר הושקע במים. התנהגות זו היה כינה שחייה המושרה שיתוק או SWIP. ניסויים קודמים הראו כי SWIP, בין השאר, נגרמת על ידי עודף של DA בתוך החריץ סינפטית זה בסופו של דבר מהתזונה קולטני postsynaptic כמו D2 (DOP-3). אמנם במקור שזוהתה dat-1 ההסתרה חיות3, SWIP הוא ציין גם אצל בעלי חיים פראי-סוג לטפל בתרופות שמונעים הפעילות של DAT (כגון imipramine4) ו/או לגרום שחרור דא (למשל, אמפטמין5). מצד שני, למנוע מניפולציות תרופתי או מחלה גנטית הסב סינתזה ושחרור של DA וחסימת פונקציה קולטן DOP-3 SWIP6. יחדיו, אלה נתונים שפורסמו כבר הקמנו SWIP בתור כלי אמין כדי לחקור את ההשפעות התנהגותית נגרם על ידי מוטציה חלבונים בתוך וכולינרגיים הסינפסות3,4,7 וכדי להיות מועסק העברה של מסכי גנטי לצורך זיהוי הרומן משעולים רגולטוריות מעורב DA איתות7,8,9,10,11,12. בנוסף, על ידי מתן של הבדיקה לכימות בקלות של שיכרון התנהגות בבעלי חיים, SWIP מאפשרת הבהרה של מנגנוני הפעולה של תרופות כמו אמפטמין (AMPH), azaperone-דופאמין synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
פרוטוקולים עבור ביצוע מבחני SWIP את תוארו לפני16. כאן נתאר בפירוט את המתודולוגיה ואת ההתקנה כדי לבצע את הבדיקה עם המטרה של מתן כמדריך חזותי עבור הקהילה C. elegans לבצע ביעילות SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבצע וזמינותו התנהגותית, SWIP, ב- C. elegans. פרוטוקול זה הוא פשוט וישיר עם לא צבעוני טכנית ביצוע assay משתמש מאוד ידידותי. למרות זאת, ישנם כמה היבטים קריטיים זה צריכים לקחת בחשבון על מנת לבצע ביעילות וזמינותו.
צריך לקחת כדי להבטיח כי התו?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות ד ר אוסמה Refai מהמעבדה של ד ר רנדי בלייקלי להדרכה עם ניתוח אוטומטיות של SWIP. עבודה זו נתמכה על ידי מימון NIH R01 DA042156 כדי LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referenzen
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
