Paralysie de natation due à évaluer la Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans
Summary
Natation induite paralysie (SWIP) est un test comportemental bien établi utilisé pour étudier les mécanismes sous-jacents de la dopamine signalisation chez Caenorhabditis elegans (c. elegans). Toutefois, une méthode détaillée pour effectuer le test fait défaut. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour SWIP.
Abstract
Le test de natation décrit dans le présent protocole est un outil valable pour identifier les protéines réglementant le dopaminergique synapses. Tout comme les mammifères, la dopamine (DA) contrôle plusieurs fonctions chez c. elegans , y compris l’activité d’apprentissage et de moteur. Conditions qui stimulent la libération de DA (p. ex., les traitements stimulants (AMPH)) ou qui empêcherait DA clearance (p. ex., les animaux dépourvus du transporteur DA (dat-1) qui sont incapables de pourraient DA dans les neurones) générer un excès de DA extracellulaire au bout du compte résultant dans la locomotion inhibée. Ce comportement est particulièrement évident lorsque les animaux nagent dans l’eau. En effet, tandis que les animaux sauvage continue à nager pendant une période prolongée, dat-1 mutants nuls et sauvage traitement avec AMPH ou inhibiteurs du transporteur DA coulent au fond du puits et ne bougent pas. Ce comportement est appelé « Paralysie due Swimming » (SWIP). Bien que l’essai SWIP est bien établie, une description détaillée de la méthode fait défaut. Nous décrivons ici un guide étape par étape pour effectuer SWIP. Pour effectuer le test, fin larvaire étape-4 animaux est placés dans une spot sur plaque de verre contenant une solution de saccharose contrôle avec ou sans AMPH. Animaux est notés pour leur comportement de nage soit manuellement par la visualisation sous un stéréoscope, soit automatiquement par l’enregistrement d’une caméra montée sur le stéréoscope. Vidéos sont ensuite analysées à l’aide d’un logiciel de suivi, ce qui donne une représentation visuelle de la fréquence de volée et paralysie sous forme de cartes de la chaleur. Les systèmes manuels et automatisés garantissent un affichage facilement quantifiable de la capacité de nage des animaux et ainsi facilitent le dépistage des animaux portant des mutations au sein du système dopaminergique ou gènes auxiliaire. En outre, SWIP peut servir à élucider le mécanisme d’action des drogues d’abus comme AMPH.
Introduction
Animaux exécutent une variété de comportements innés et complexes qui sont véhiculées par les différents neurotransmetteurs, coordonnés par les processus complexes de signalisation. La dopamine, un neurotransmetteur (DA) intervient dans des comportements hautement conservées à travers les espèces, y compris l’apprentissage, la fonction motrice et le traitement de la récompense.
Les nématodes du sol c. elegans, avec un système nerveux relativement simple et bien cartographiée consistant seulement 302 neurones, montre des comportements fortement complexes, dont beaucoup sont réglementées par DA comme accouplement, apprentissage, recherche de nourriture, la locomotion et la ponte 1. parmi les autres caractéristiques, cycle de vie court, facilité de manipulation et la conservation des molécules de signalisation, mettre en évidence les avantages de l’utilisation de c. elegans comme modèle pour étudier les bases neurales des comportements conservées.
L’hermaphrodite c. elegans contient huit des neurones dopaminergiques ; En outre, le mâle contient six paires supplémentaires pour fins d’accouplement. Comme les mammifères, ces neurones synthétisent DA et expriment le transporteur DA (DAT-1), une protéine de membrane trouve exclusivement dans les neurones dopaminergiques, qui transporte DA relâché dans la fente synaptique dans les neurones dopaminergiques. En outre, la plupart des protéines impliqués dans chaque étape de la synthèse, de conditionnement et de libération de DA est hautement conservée entre worms et les êtres humains et, comme chez les mammifères, DA module alimentation de comportements et de locomotion chez c. elegans2.
C. elegans se traîne sur des surfaces solides et nage avec un comportement caractéristique de s’emballer dans de l’eau. Fait intéressant, des mutants dépourvus d’expression du 1 DAT (dat-1) rampent normalement sur une surface solide, mais ne parviennent pas à maintenir la natation lorsqu’immergé dans l’eau. Ce comportement a été appelé natation induite une paralysie, ou SWIP. Des expériences précédentes ont démontré que SWIP, est en partie causée par un excès de DA dans la fente synaptique qui finalement surexcite les récepteurs postsynaptiques de D2-like (DOP-3). Bien qu’identifié à l’origine de dat-1 knockout animaux3, SWIP est également observée chez les animaux sauvage, traités avec des médicaments qui bloquent l’activité de DAT (p. ex., l’imipramine4) et/ou inciter la libération de DA (p. ex., stimulants5). En revanche, les manipulations pharmacologiques ou génétiques conjurer la synthèse et la libération de DA et bloquant la fonction des récepteurs DOP-3 empêchent SWIP6. Pris ensemble, ces données déjà publiées ont établi SWIP comme un outil fiable pour étudier les effets comportements de protéines mutées dans dopaminergique synapses3,4,7 et devant être utilisés pour avancer les écrans génétiques pour l’identification de nouvelles voies réglementaires impliquées dans DA signalisation7,8,9,10,11,12. En outre, en fournissant un affichage facilement quantifiable du comportement drogue-induite chez les individus vivants, SWIP permet à l’élucidation des mécanismes d’action des drogues comme l’amphétamine (AMPH) et azapérone à la dopaminergique synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocoles pour effectuer les dosages SWIP ont été décrits avant16. Ici, nous décrivons en détail la méthodologie et le programme d’installation pour effectuer le test avec le but de fournir un guide visuel pour la communauté de c. elegans remplir efficacement SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour effectuer un test comportemental, SWIP, chez c. elegans. Ce protocole est simple et directe avec aucun obstacles techniques majeurs effectuez ce test très amical. Néanmoins, il y a certains aspects essentiels qui doivent être examinées afin de s’acquitter efficacement le dosage.
Il faut s’assurer que les vers utilisés pour l’essai sont bien nourris, puisque la restriction alimentaire affecte SWIP17</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiens à remercier le Dr. Osama Refai du laboratoire du Dr Randy Blakely d’orientation avec l’analyse automatique de SWIP. Ce travail a été financé par NIH R01 DA042156 à LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referenzen
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