Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo
Summary
Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de “teste” e “controle”, este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.
Abstract
O controle do gene da Citoarquitetura neuronal é atualmente o assunto da investigação intensiva. Descrito aqui é um método simples desenvolvido para estudar o controle genético in vivo da morfologia do neurônio da projeção neokortikalny. Este método é baseado em (1) Engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais como células de “teste” e “controle”, (2) seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e (3) avaliação morfométrica pareada de seus derivados neuronais. Especificamente, os precursores paliais E 12.5 dos doadores panneuronal, geneticamente rotulados, são empregados para este fim. São projetados para tirar proveito dos promotores selecionados e da tecnologia tetON/OFF, e são transplantados à mão livre em ventrículos laterais neonatais. Mais tarde, após a criação de perfil de imunofluorescência de cérebros destinatários, silhuetas de neurônios transplantados são alimentados em software de código aberto NeurphologyJ, seus parâmetros morfométricos são extraídos, e o comprimento médio e índice de ramificação são calculados. Comparado a outros métodos, este oferece três vantagens principais: permite conseguir do controle fino da expressão do transgene a custos disponíveis, ele exige somente habilidades cirúrgicas básicas, e fornece resultados estatisticamente confiáveis em cima da análise de um limitado número de animais. Por causa de seu projeto, entretanto, não é adequado endereçar o controle não Cell-Autonomous do neuroarchitecture. Além disso, deve ser usado preferencialmente para investigar o controle da morfologia do neurite após a conclusão da migração neuronal. Em sua formulação atual, este método é afinado primorosamente para investigar o controle do gene da arquitetura neokortikalny glutamatérgico do neurônio. Aproveitando-se de linhas transgênicas expressando EGFP em outros tipos específicos de células neurais, pode ser re-purposed para abordar o controle genético de sua arquitetura.
Introduction
Aqui nós descrevemos um método simples que nós desenvolvemos para dissecar in vivo o controle do gene da Citoarquitetura neuronal. Com base na engenharia in vitro de precursores neuronais, seu transplante em cérebro neonatal e avaliação morfométrica pareada de células de “teste” e “controle”, permite desvendar as implicações funcionais dos genes de teste no controle fino da morfologia neuronal em um forma rápida e acessível. Para investigar o controle genético in vivo da arquitetura neuronal, três questões técnicas fundamentais devem ser abordadas: (1) alcançar uma expressão de gene-de-interesse (GOI) adequadamente padronizada e um controle quantitativo exato da mesma; (2) obtenção de uma visualização segmentada adequada de silhuetas neuronais distintas; (3) elicitar a significância estatística dos resultados, empregando um número limitado de animais.
Quando disponível, as linhas mutantes do rato que abriam transgenes controlados do tetraciclina (Tet) podem ser a melhor ferramenta para endereçar a primeira edição1. Alternativamente, a transgênese somática pode ser empregada. Nesses casos, o transgene é entregado através do Electroporation2 ou da transdução viral3. Em seguida, é mantido como um episome (por exemplo, em cima do Electroporation padrão4), ou está integrado no genoma (aleatòria, através da integrase retroviral5; ou em uma posição definida, através do recombinação homous-promovido crispr (slendr)6 ).
Em segundo lugar, a visualização da silhueta neuronal pode ser conseguida através de (a) rotulagem uniforme esparsa ou (b) rotulagem diferencial densa. Quanto à rotulagem esparsa, as metodologias avançadas do tipo Golgi podem ser empregadas7, minisets neuronais selecionados podem ser preenchidos por biocitina8, e a rotulagem de sal e pimenta pode ser obtida graças a um transgene escassamente expresso. Tal transgene pode exibir a transcrição variegada (thy-EGFP)9 ou pode ser ativada por recombinação estocástica (Morf)10. Quanto a (b), as estratégias de estado de arte incluem recombinação estocástica mediada por CRE dentro de uma matriz de transgenes de fluoroproteína multifloxed (Brainbow)11, bem como a integração genômica guiada por piggyBac-transposase de genes de fluoroproteína, anteriormente entregues via transgénese somática (CLoNE)12.
Quanto à terceira questão, o desfecho morfométrico é freqüentemente afetado por uma grande variabilidade aleatória, originando-se de diferenças entre animais e contingências de injeção celular. Devido a isso, um grande número de animais geralmente é empregado para atingir o poder estatístico necessário para avaliar a atividade morfométrica GOI.
As abordagens anteriormente descritas freqüentemente dependem de habilidades técnicas avançadas e exigem recursos financeiros evidentes, o que pode limitar sua difusão dentro da comunidade científica. Para contornar essas questões, concebemos um pipeline fácil e direto para dissecar o controle genético da neuroarquitetura in vivo de forma rápida e acessível. Isto é inspirado por um projeto similar do cotransplante desenvolvido previamente para a avaliação in vivo rápida da atividade a13do transgene.
Especificamente, pensa-se que o cotransplante de in vitro projetado “verde” precursores neurais (“teste” e “controle” células) em um “preto” receptor neonatal cérebro pode simultaneamente corrigir as três principais questões listadas acima. De fato, a engenharia lentivirais in vitro de precursores, em condições bem controladas, permite a manutenção da variabilidade da expressão neuronal transgênica no mínimo, muito abaixo do que geralmente está associado com manipulações somáticas in vivo (realizadas anteriormente 14 anos de , 15 e em nossos resultados inéditos). O controle exato resultante da expressão gênica é comparável com o obtido por modelos transgênicos controlados por Tet. No entanto, os custos deste procedimento são muito inferiores àqueles provenientes da manutenção de uma linha de rato transgénica. Em seguida, a injeção livre da pilha da mão é fácil e exige o treinamento mínimo. Além disso, a quantidade de precursores rotulados injetado em cada cérebro pode ser facilmente ajustada para alcançar um número cumulativo suficiente de precursores esparsamente distribuídos, ao mesmo tempo que mantém o número total de animais transplantados no mínimo. Por último, mas não menos importante, a coinjeção de precursores de “teste” e “controle” de forma diferente, com rótulo de fluoro, e posterior análise estatística pareada dos resultados neutram os efeitos da variabilidade experimental interanimal, permitindo o alcance de significância estatística dos resultados, mesmo após a análise de um número limitado de indivíduos13.
Ressalta-se que, embora rápido e barato, esse método tem duas limitações principais. Primeiramente, é projetada investigar o controle Cell-Autonomous do gene da arquitetura neuronal, e não é apropriado endereçar o controle ambiental. Em segundo lugar, como precursores neuronais transplantados chegar a sua localização final por um cronograma heterocrônico, este método é preferível para modelar neuroarchitectonics controle ocorrendo após a conclusão da migração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aspectos específicos/etapas deste procedimento são críticos e exigem atenção especial. Primeiro, (a) os operadores devem ser adequadamente treinados para manipular com segurança Lentivirus em um ambiente de laboratório compatível com BSL-2. Em segundo lugar, (b) antes de misturar “teste” e “controle” preparações neurais, é obrigatório lavar cuidadosamente as duas suspensões de neuroesfera correspondentes, como descrito, a fim de evitar qualquer atraso na infecção cruzada das duas preparações devido a Len…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mihn Duc do pela sua contribuição para a criação precoce deste procedimento.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
Referenzen
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