생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식
Summary
신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 “테스트”와 “제어”유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.
Abstract
신경 세포 아키텍처의 유전자 제어는 현재 집중적 인 조사의 대상이됩니다. 여기서 설명된 간단한 방법은 신피질 프로젝션 뉴런 형태학의 생체 내 유전자 조절을 연구하기 위해 개발된 간단한 방법이다. 이 방법은 (1) 신경 전구체의 시험관 내 렌티바이러스 공학을 “시험” 및 “대조군” 세포로, (2) 야생형 뇌로의 공동 이식, 및 (3) 그들의 신경 유도체의 쌍형 형태측정 평가에 기초한다. 특히, E12.5 panneuronal에서 창 구체, 유전적으로 표지 된 기증자, 이 목적을 위해 사용 됩니다. 그들은 선택된 프로모터와 tetON /OFF 기술을 활용하도록 설계되었으며 신생아 측삭 실로 자유롭게 이식됩니다. 나중에, 수신자 두뇌의 면역 형광 프로파일링시, 이식된 뉴런의 실루엣은 NeurphologyJ 오픈 소스 소프트웨어로 공급되고, 그들의 형태 측정 파라미터는 추출되고, 평균 길이 및 분기 지수는 계산됩니다. 다른 방법에 비해, 이것은 세 가지 주요 장점을 제공합니다 : 그것은 저렴한 비용으로 이식 유전자 발현의 미세 한 제어를 달성 할 수 있습니다, 그것은 단지 기본적인 수술 기술을 필요로하고, 제한된의 분석에 통계적으로 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다 동물의 수. 그것의 디자인 때문에, 그러나, 신경 건축의 비 세포 자율적인 통제를 다루기 위하여 적시이지 않습니다. 더욱이, 신경이동이 완료된 후 신경외형태 조절을 조사하는 것이 바람직하게는 사용되어야 한다. 본 제형에서, 이 방법은 글루타마테르기성 신피질 뉴런 아키텍처의 유전자 제어를 조사하기 위해 정교하게 조정된다. 다른 특정 신경 세포 유형에서 EGFP를 발현하는 형질전환 라인을 활용하면, 그들의 아키텍처의 유전자 제어를 해결하기 위해 재사용될 수 있다.
Introduction
여기에서 우리는 우리가 신경 세포 건축의 생체 내 유전자 통제를 해부하기 위하여 개발한 간단한 방법을 기술합니다. 신경 전구체의 시험관 내 공학에 기초하여, 신생아 뇌로의 이식 및 “테스트”와 “제어”세포의 쌍 형태 평가, 그것은 에서 신경 형태학의 미세 한 제어에 테스트 유전자의 기능적 의미를 공개 할 수 있습니다 빠르고 저렴한 방법. 뉴런 아키텍처의 생체 내 유전자 제어를 조사하려면 세 가지 주요 기술적 문제를 해결해야 합니다: (1) 적절한 패턴의 유전자(GOI) 발현및 정확한 정량적 제어를 달성하는 것; (2) 뚜렷한 뉴런 실루엣의 적절히 분할된 시각화를 얻는 것; (3) 제한된 수의 동물을 고용하면서 결과의 통계적 유의성을 유도한다.
가능하면, 테트라사이클린(tet)-제어형 트랜스게네전지유전자를 항하는 마우스 돌연변이선은제1호를 해결하는 가장 좋은 도구일 수 있다. 대안적으로, 체세포 성 족제는 채택될 수 있다. 이러한 경우, 이식유전자는 전기천공2 또는 바이러스성 전달3을 통해 전달된다. 다음으로, EPIsome (예를 들어, 표준 전기 포더레이션4시) 또는 게놈에 통합됩니다 (무작위로, 레트로바이러스 인테그라제 5를 통해; 또는 정의된 위치에서, CRISPR 촉진 상동성 재조합 (SLENDR)6 ).
둘째, 뉴런 실루엣 시각화는 (a) 희소 균일 한 라벨링 또는 (b) 조밀한 차동 라벨링을 통해 달성될 수 있다. 희소라벨링에 관해서는, 고급 골지유사 방법론은 7,선택된 뉴런 미니세트는 바이오시틴8에의해 채워질 수 있고, 염-후추 라벨링은 희소하게 발현된 트랜스유전자 덕분에 얻어질 수 있다. 이러한 이식유전자는 변종 전사(Thy-EGFP) 9를 표시하거나 단층 재결합(MORF)(MORF)에의해 활성화될 수 있다. (b)에 관해서는, 최첨단 전략은 다중 플록스형 형광단백질 이식유전자 어레이(Brainbow)11,뿐만 아니라 피기박-트랜스포사아제 구동 형단백질 유전자의 게놈 통합, 이전에 내의 Cre-중재된 확률재조합을 포함한다. 체세포 전염 (CLoNE)을 통해 전달12.
세 번째 문제에 관해서는, 형태 측정 결과는 종종 동물 간 차이 및 세포 주입 사태에서 기인하는 큰 무작위 가변성에 의해 영향을 받습니다. 이 때문에, 많은 수의 동물들이 일반적으로 GOI 형태 측정 활성을 평가하는 데 필요한 통계적 힘을 달성하기 위해 사용된다.
앞서 설명한 접근법은 종종 고급 기술 기술에 의존하고 과학계 내에서 확산을 제한할 수 있는 눈에 띄는 재정 적 자원이 필요합니다. 이러한 문제를 피하기 위해, 우리는 빠르고 저렴한 방법으로 생체 내에서 신경 아키텍처의 유전자 제어를 해부하는 쉽고 간단한 파이프 라인을 구상했다. 이는 항모세포 이식 유전자 활성(13)의 빠른 생체 내 평가를 위해이전에 개발된 유사한 공동 이식 설계에서 영감을 받았다.
구체적으로, 시험관 내 설계 “녹색” 신경 전구체(“테스트” 및 “대조군” 세포)를 “검정” 수용자 신생아 뇌로 동시 이식하면 위에 열거된 세 가지 주요 문제를 동시에 해결할 수 있다고 생각됩니다. 사실, 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학, 잘 제어 된 조건에서, 최소의 신경 이식 유전자 발현의 가변성의 유지 보수를 허용, 훨씬 아래 그 일반적으로 생체 내 체세포 조작과 관련된 (이전에 수행 14세 , 15 및 게시되지 않은 결과). 그 결과 유전자 발현의 정확한 제어는 테트 제어 형질전환 모델에 의해 달성된 것과 비교할 수 있다. 그러나, 이 절차의 비용은 형질전환 마우스 라인의 유지 보수에서 유래하는 그보다 훨씬 낮습니다. 다음으로, 자유 로운 손 세포 주입은 쉽고 최소한의 훈련이 필요합니다. 더욱이, 각 뇌에 주입된 표지된 전구체의 양은 이식된 동물의 총 수를 최소한으로 유지하면서, 희소하게 분포된 전구체의 충분한 누적 수를 달성하기 위해 용이하게 조정될 수 있다. 마지막으로, 상이한 불소 표지, “테스트” 및 “제어” 전구체의 공동 주사제 및 결과에 대한 후속 쌍별 통계 분석은 동물 간 실험 가변성의 효과를 중화하여 결과의 통계적 유의성, 심지어 개인의 제한된 수의 분석에 따라13.
빠르고 저렴하지만이 방법은 두 가지 주요 제한 사항이 있음을 강조해야합니다. 첫째, 뉴런 아키텍처의 세포 자율 유전자 제어를 조사하도록 설계되었으며 환경 제어를 해결하는 것은 적절하지 않습니다. 둘째, 이식된 뉴런 전구체가 이종성 스케줄에 의해 최종 위치에 도달함에 따라, 이 방법은 과거 마이그레이션 완료가 발생하는 신경설계학적 제어를 모델링하는 것이 바람직하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차의 특정 측면/단계는 매우 중요하며 특별한 주의가 필요합니다. 첫째, (a) 운영자는 BSL-2 를 준수하는 실험실 환경에서 렌티바이러스를 안전하게 조작할 수 있도록 적절하게 사전 교육을 받아야 합니다. 둘째, (b) 신경 제제를 혼합하기 전에, 설명된 바와 같이 두 개의 상응하는 신경구 현탁액을 조심스럽게 세척하여, 원치 않는 렌티바이러스로 인한 두 제제의 지연된 교차 감염을 방지하기 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 절차의 초기 설정에 그의 기여에 대한 미안 덕 도 감사합니다.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
Referenzen
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
