Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

La neurogénesis adulta es un proceso biológico por el cual nacen nuevas neuronas en un adulto e integradas en las redes neuronales existentes¹. En los seres humanos, este proceso se produce en el gyrus dentalado (DG)del hipocampo, donde nacen alrededor de 1.400 nuevas células cada día 2. Estas células residen en la parte interna de la DG, que alberga un nicho neurogénico, llamado zona subgranular (SGZ). Aquí, las células madre neurales adultas hipocampales (NSC) se someten a un complejo proceso de desarrollo para convertirse en neuronas completamente funcionales que contribuyen a la regulación de funciones cerebrales específicas, incluyendo el aprendizaje y la memoria, regulación del estado de ánimo, y la respuesta al estrés^{3 ,4,5,6}. Para influir en los comportamientos, los SCN adultos están altamente regulados por varios estímulos externos de una manera dependiente de la actividad respondiendo a una serie de señales químicas locales y distales. Estas señales químicas incluyen neurotransmisores y neuromoduladores y actúan de una manera específica de circuito de varias regiones cerebrales. Es importante destacar que la convergencia de circuito según estas señales químicas en los SCN permite una regulación única y precisa de las decisiones de activación, diferenciación y destino de células madre.

Una de las formas más efectivas de interrogar la regulación del circuito de los NSC adultos in vivo es emparejando el análisis de inmunofluorescencia con manipulaciones de circuitos anchos. El análisis de inmunofluorescencia de los SCN adultos es una técnica comúnmente utilizada, donde los anticuerpos contra marcadores moleculares específicos se utilizan para indicar la etapa de desarrollo de los SCN adultos. Estos marcadores incluyen: nestin como célula de glia radial y marcador de progenitor neural temprano, Tbr2 como marcadorde progenitor intermedio, y dcx como marcador de neurona neuroblast e inmaduro 7. Además, mediante la administración de análogos de timidina como BrdU, CidU, Idu, y Edu, las poblaciones celulares sometidas a la fase S se pueden etiquetar y visualizar individualmente^8,9,10. Mediante la combinación de estos dos enfoques, se puede investigar una amplia gama de preguntas que van desde cómo se regula la proliferación en etapas específicas del desarrollo, hasta cómo diversas señales afectan a la diferenciación de nSC y la neurogénesis.

Existen varias opciones para manipular eficazmente los circuitos neuronales, incluyendo la estimulación eléctrica, la optogenética y la quimiogenética, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. La estimulación eléctrica implica una cirugía extensa donde los electrodos se implantan en una región cerebral específica que más tarde se utilizan para transmitir señales eléctricas para modular una región cerebral dirigida. Sin embargo, este enfoque carece de especificidad celular y de circuito. La optogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor activado por luz que es estimulado por un láser emitido a través de una fibra óptica implantada, pero requiere manipulaciones extensas, gran costo y cirugías complejas^11. La quimiogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor de diseño activado exclusivamente por fármacos de diseño o DREADD, que posteriormente son activados por un ligando específico y biológicamente inerte conocido como óxido N de clozapina (CNO)¹² . La ventaja de utilizar DREADD para manipular circuitos neuronales locales que regulan los SCN adultos radica en la facilidad y varias rutas de administración de CNO. Esto permite un enfoque menos lento con un manejo animal reducido, que es fácilmente adaptable para estudios a largo plazo para modular los circuitos neuronales.

El enfoque descrito en este protocolo es una colección completa de varios protocolos necesarios para interrogar con éxito la regulación del circuito de la neurogénesis del hipocampo adulto que combina tanto técnicas de inmunofluorescencia como manipulaciones de circuitos uso de la quimiogenética. El método descrito en el siguiente protocolo es adecuado para estimular o inhibir uno o varios circuitos simultáneamente in vivo para determinar su función reguladora en la neurogénesis adulta. Este enfoque se utiliza mejor si la pregunta no necesita un alto grado de resolución temporal. Las preguntas que requieren un control temporal preciso de la estimulación/inhibición a una frecuencia determinada, pueden abordarse mejor utilizando optogenética^13,14. El enfoque descrito aquí se adapta fácilmente para estudios a largo plazo con un manejo mínimo de animales, especialmente cuando el estrés es una preocupación importante.