Assaying Circuit Специфическое регулирование взрослых гиппокампальных нейронных клеток-предшественников

Взрослый нейрогенез является биологическим процессом, с помощью которого новые нейроны рождаются во взрослом возрасте и интегрированы в существующие нейронные сети¹. У людей этот процесс происходит в зубной извилине (DG) гиппокампа, где около 1400 новых клеток рождаются каждый день². Эти клетки находятся во внутренней части ГД, которая таит в себе нейрогенную нишу, именуемую субгралярной зоной (СГЗ). Здесь гиппокампа взрослых нервных стволовых клеток (NSCs) проходят сложный процесс развития, чтобы стать полностью функциональными нейронами, которые способствуют регуляции конкретных функций мозга, в том числе обучения и памяти, регулирование настроения, и стресс ответ^{3 ,}4,^5,6. Чтобы влиять на поведение, взрослые НСК строго регулируются различными внешними стимулами в деятельности, зависимой от этого, реагируя на массив местных и дистальных химических сигналов. Эти химические сигналы включают нейротрансмиттеров и нейромодуляторов и действовать в цепи определенным образом из различных областей мозга. Важно отметить, что широкая конвергенция этих химических сигналов на НСК позволяет проводить уникальную и точную регуляцию активации стволовых клеток, дифференциацию и судьбу решений.

Одним из наиболее эффективных способов допроса регулирования схем взрослых NSCs in vivo является сопряжение иммунофлуоресценции анализа с цепью широкие манипуляции. Иммунофлуоресценция анализ взрослых НСК является широко используемым методом, где антитела против конкретных молекулярных маркеров используются для обозначения стадии развития взрослых НСК. Эти маркеры включают в себя: nestin как клетка радиальной глии и ранний нейронный маркер прародителя, Tbr2 как промежуточный маркер прародителя, и dcx как нейробласт и незрелый маркер нейронов⁷. Кроме того, путем введения тимидина аналогов, таких как BrdU, CidU, Idu, и Edu, популяции клеток, проходящие фазу S могут быть индивидуально помечены и визуализированы^8,9,10. Объединив эти два подхода, широкий спектр вопросов может быть исследован, начиная от того, как распространение регулируется на конкретных стадиях развития, как различные сигналы влияют на дифференциацию НСК и нейрогенез.

Существует несколько вариантов эффективного управления нейронными схемами, включая электрическую стимуляцию, оптогенетику и хемогенетику, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Электрическая стимуляция включает в себя обширную операцию, где электроды имплантируются в конкретную область мозга, которые позже используются для передачи электрических сигналов для модулирования целевой области мозга. Однако, этот подход не хватает как клеточной и цепи специфики. Оптогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют свет активированный рецептор, который стимулируется лазером, испускаемым через имплантированное оптическое волокно, но требует обширных манипуляций, больших затрат и сложных операций¹¹. Хемогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют дизайнерский рецептор, исключительно активированный дизайнерскими препаратами или DREADDs, которые впоследствии активируются специфическим и биологически инертным лигандом, известным как клозапин N-оксид (CNO)¹² . Преимущество использования DREADDs для манипулирования локальными нейронными схемами, которые регулируют взрослые НСК, заключается в легкости и различных маршрутах управления CNO. Это позволяет менее трудоемкий подход с сокращением обработки животных, который легко адаптируется для долгосрочных исследований, чтобы модулировать нейронных цепей.

Подход, описанный в этом протоколе, представляет собой всеобъемлющий набор различных протоколов, необходимых для успешного допроса схемы регулирования взрослых гиппокампа нейрогенеза, который сочетает в себе как методы иммунофлюоресценции и схемы манипуляций с помощью хемогенетики. Метод, описанный в следующем протоколе, подходит для стимулирования или ингибирования одной или нескольких цепей одновременно in vivo, чтобы определить их регулирующую функцию на взрослых нейрогенеза. Этот подход лучше всего использовать, если вопрос не нуждается в высокой степени временного разрешения. Вопросы, требующие точного временного контроля стимуляции / ингибирования на определенной частоте, могут быть лучше решены с помощью оптогенетики^13,14. Описанный здесь подход легко адаптируется для долгосрочных исследований с минимальным обращением с животными, особенно в тех случаях, когда стресс является серьезной проблемой.