성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술
Summary
이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.
Abstract
성체 신경 발생은 치과 자이러스 (DG)의 하부 영역 (SGZ)에서 새로 활성화 된 신경 줄기 세포 (NSC)가 새로운 뉴런을 생성하는 동적 과정으로, 이는 기존 신경 회로에 통합되어 특정 해마 기능에 기여합니다. . 중요한 것은, 성인 신경 발생은 환경 자극에 매우 취약, 다양 한 인지 기능의 활동에 의존 하는 규칙에 대 한 허용. 다양 한 뇌 영역에서 신경 회로의 광대 한 범위는 이러한 복잡 한 인지 기능을 조율. 따라서 특정 신경 회로가 성인 신경 발생을 조절하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 여기에서는 설치류에서 NSC와 신생아 자손을 조절하는 디자이너 약물(DREADDs) 기술에 의해 독점적으로 활성화된 디자이너 수용체를 사용하여 신경 회로 활동을 조작하는 프로토콜을 설명합니다. 이 포괄적인 프로토콜에는 바이러스 입자의 입체 주입, 특정 신경 회로의 화학 유전적 자극, 티미딘 아날로그 투여, 조직 처리, 면역 형광 라벨링, 공초점 이미징 및 이미징이 포함됩니다. 신경 전구체 세포의 다양한 단계의 분석. 이 프로토콜은 NSC와 그들의 자손을 시각화하는 데 사용되는 항원 검색 기술에 대한 자세한 지침을 제공하고 클로자핀 N-산화물 (CNO) 또는 CNO 함유 식수를 사용하여 뇌 회로를 조절하는 간단하면서도 효과적인 방법을 설명하고 공포 표현 바이러스. 이 프로토콜의 강도는 신경 세포에서 파생 된 성인 신경 발생에 영향을 미치는 신경 회로의 다양 한 범위를 연구 하는 적응성에 있다.
Introduction
성체 신경 발생은 새로운 뉴런이 성인에서 태어나 기존 신경망에통합되는 생물학적 과정입니다 1. 인간에서는, 이 프로세스는 해마의 치과 gyrus (DG)에서, 대략 1,400의새로운 세포가 매일 2 에서 태어난 곳에 생깁니다. 이 세포는 신경성 틈새 시장을 품고 있는 DG의 안쪽 부분에, 상체 지역 (SGZ)에게 불려 있습니다. 여기서, 해마 성인 신경 줄기 세포 (NSC)는 학습 및 기억, 기분 조절 및 스트레스 반응을 포함하여 특정 뇌 기능의 조절에 기여하는 완전한 기능의 뉴런이되기 위한 복잡한 발달 과정을 거칩니다3 ,4,5,6. 행동에 영향을 미치기 위하여는, 성숙한 CSCs는 현지 및 원위 화학 단서의 배열에 반응하여 활동 의존적인 방식으로 각종 외부 자극에 의해 높게 통제됩니다. 이러한 화학 단서 신경 전달 물질 및 신경 변조기 를 포함 하 고 다양 한 뇌 영역에서 회로 특정 방식으로 행동. 중요한 것은, NSC에 이러한 화학 큐의 회로 넓은 수렴은 줄기 세포 활성화, 분화 및 운명 결정의 독특하고 정확한 조절을 허용합니다.
생체 내에서 성인 NSC의 회로 조절을 심문하는 가장 효과적인 방법 중 하나는 면역 형광 분석을 회로 폭 넓은 조작과 페어링하는 것입니다. 성인 신경전의 면역 형광 분석은 일반적으로 이용되는 기술입니다, 여기서 특정 분자 마커에 대하여 항체는 성인 신경침판의 발달 단계를 표시하기 위하여 이용됩니다. 이들 마커는 다음을 포함한다: 방사형 신경교세포 및 초기 신경 전구 마커로서 네스테인, 중간 전구 마커로서 Tbr2, 및 뉴라블라스트 및 미성숙 뉴런 마커로서 dcx7. 부가적으로, BrdU, CidU, Idu 및 Edu와 같은 티미딘 유사체를 투여함으로써, S상을 겪고 있는세포 집단은 개별적으로 표지되고 가시화될 수 있다 8,9,10. 이 두 접근을 결합하여, 각종 단서가 NSC 분화 및 신경 발생에 어떻게 영향을 미치는지에, 특정 발달 단계에서 증식이 어떻게 통제되는지에 이르기까지 광범위한 질문을 조사할 수 있습니다.
전기 자극, 광유전학 및 화학 유전학을 포함하여 신경 회로를 효과적으로 조작하기 위해 여러 가지 옵션이 존재하며, 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 전기 자극은 전극이 나중에 표적으로 한 두뇌 지구를 조절하기 위하여 전기 신호를 전송하기 위하여 이용되는 특정 두뇌 지구에 이식되는 광대한 수술을 관련시킵니다. 그러나, 이 접근은 세포와 회로 특이성이 둘 다 결여합니다. 광유전학은 이식된 광섬유를 통해 방출되는 레이저에 의해 자극되는 광 활성화 수용체를 인코딩하는 바이러스 입자의 전달을 수반하지만, 광범위한 조작, 큰 비용 및 복잡한 수술이 필요하다11. 화학 유전학은 디자이너 약물 또는 DREADDs에 의해 독점적으로 활성화 된 디자이너 수용체를 인코딩하는 바이러스 입자의 전달을 포함하며, 이는 클로자핀 N-산화물 (CNO)12로 알려진 특정 및 생물학적 불활성 리간드에 의해 이후에 활성화됩니다. . DREADDs를 활용하여 성인 NSC를 조절하는 로컬 신경 회로를 조작하는 장점은 CNO 관리의 용이성과 다양한 경로에 있습니다. 이를 통해 동물 취급이 감소되어 시간이 덜 소요되는 접근 방식을 사용할 수 있으며, 이는 신경 회로를 조절하기 위한 장기 연구에 쉽게 적용 가능합니다.
이 프로토콜에 기술된 접근법은 면역형광 기술과 회로 조작을 모두 결합한 성인 해마 신경 발생의 회로 조절을 성공적으로 심문하는 데 필요한 다양한 프로토콜의 포괄적인 모음입니다. 화학 유전학을 사용하여. 다음 프로토콜에 기재된 방법은 성인 신경 발생에 대한 그들의 조절 기능을 결정하기 위해 생체 내에서 동시에 하나 또는 다중 회로를 자극하거나 억제하는 데 적합하다. 이 방법은 질문에 높은 수준의 시간적 해상도가 필요하지 않은 경우에 가장 적합합니다. 특정 주파수에서 자극 /억제의 정확한 시간적 제어를 필요로하는 질문은 광유전학13,14를사용하여 더 잘 해결할 수 있습니다. 여기에 설명된 접근법은 스트레스가 주요 관심사인 특히 최소한의 동물 취급으로 장기적인 연구에 쉽게 적용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 목표는 특정 신경 회로를 조작하는 것이 일련의 면역 조직 화학 기술을 사용하여 생체 내에서 성인 해마 신경 발생을 조절하는 방법을 평가하는 것입니다. 특정 신경 회로에 의해 매개된 성인 신경 발생의 활성 의존적 조절을 분석하는 것은 다양한 범위의 신경 회로를 연구하기 위한 수정가능성이 큰 귀중한 기술이다. 이러한 유형의 실험의 성공은 정확한 바이러스 전달, 원하는 조…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q.는 다양성 보충 R01MH11773뿐만 아니라 T32 훈련 교부금 T32NS007431-20에서 건강의 국립 연구소의 정신 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 프로젝트는 NIH(MH111773, AG058160 및 NS104530)로부터 J.S.에게 수여된 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Referenzen
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
