생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

인간의 RSV 유아 전세계¹급성 호흡기 감염에 대 한 입원의 주요 원인입니다. 또한, RSV 성인 입원 및 사망 부담 노인²의 대부분과 인플루엔자에 비해 상당한 질병 부담으로 연결 됩니다. 있습니다 없습니다 백신 또는 특정 antivirals RSV에 대 한 약속 하지만 아직 신약 개발^3,4에 있습니다. 복잡성과 RSV 곱셈의 정량화 기법의 무 거 움 antivirals 또는 현재 상당한 노력에도 불구 하 고 백신에 대 한 검색을 방해. 생체 외에서 RSV 곱셈의 정량화 분석 실험, 양적 현미경 검사 법, immunostaining, 플 라크 감소 cytopathic 효과의 분석에서 주로 구성 되어 힘 드는 시간과 비싼 방법에 따라 일반적으로 역전사 (qRT)-연쇄 반응 (PCR), 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 테스트. 수정 된 유전자와 같은 기자 유전자 표현 바이러스는 GFP 코딩, 같은 검 진을 위해 더 적당 한. 자동된 판 독자를 사용 하 여 결합, 기자 재조합 바이러스 유전자를 운반 할 수 있습니다 이러한 분석 표준화 및 높은 처리량을 위해 더 적당 한.

RSV는 엔벌로프된, nonsegmented 부정적인 감 RNA 바이러스 Pneumoviridae 가족, 순서 Mononegavirales⁵ Orthopneumovirus 속에 속하는입니다. RSV 게놈의 약 15, 지도자 및 트레일러와 인코딩 11 단백질의 transcriptional 단위 10 개 3’와 5′ 말단에 noncoding 지역 포함 된 단일 스트랜드, 부정 감지 RNA 이다. 유전자는 다음과 같이 정렬 됩니다: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, m 2 (m 2-1과 m 2-2 단백질에 대 한 인코딩) 및 L-5′. 게놈 RNA는 밀접 하 게 포장 하 여 nucleoprotein 서식 파일로 사용 하는 북 아 일 하 encapsidated 게놈 RNA, 바이러스 성 RNA 의존 RNA 중 합 효소 (RdRp) 전사 및 바이러스 성 RNA의 복제를 보장 합니다. 바이러스 성 RdRp 큰 단백질 L 당 뉴클레오티드 중 합 효소 활동을 운반의 구성, 그것의 필수 공동 인자 phosphoprotein P와 바이러스 성 녹음 방송으로 하는 M2-1 단백질 요소⁶. 감염 된 세포에서 RSV 세포질 포함 이라고 포함 시체 (IBs)의 형성을 유도 합니다. 형태학 상으로 비슷한 세포질 포함 여러 Mononegavirales^7,8,,910관찰 되었습니다. RSV 바이러스 성 RNA 합성 따라서 바이러스 성 공장^8,,911, 로 간주 될 수 있는 IBs에서 발생 하는 것을 보여주었다, 에볼라 바이러스, vesicular 구내 염 바이러스 (VSV), 광견병 바이러스에 대 한 최근 연구 ¹². 바이러스 공장 RNA 그리고 바이러스 성 RNA 합성에 필요한 바이러스 성 단백질을 집중 하 고 또한 포함 하는 세포질 단백질^{13,,1415,16, 17}. IBs 전시 IB 관련 된과 립 (IBAGs), 집중 하 라는 기능 subcompartment는 새로 synthetized M2-1 단백질 함께 초기 바이러스 성 mRNA. 게놈 RNA와 L, P, 그리고 N IBAGs에서 검색 되지 않습니다. IBAGs는 액체 세포¹²의 속성을 전시 하는 IBs 안에 작은 동적 구형 구조. IBs 중앙 역할 바이러스 곱셈에 불구 하 고 아주 작은 자연, 내부 구조, 형성, 및이 바이러스 성 공장 운영에 대 한 알려져 있다.

한 cDNA에서 소아마비의 게놈의 식 1981¹⁸첫 번째 전염 성 바이러스 성 복제의 생산을 사용할 수 있습니다. 단일 가닥 부정적인 RNA 바이러스, 그것 아니었다 1994 년까지 셀¹⁹ 에 플라스 미드의 transfection를 다음 첫 번째 광견병 바이러스의 생산 장소를 했다. 첫 번째 플라스 미드 역 유전 위한 기반 시스템 RSV 1995²⁰에 출판 되었음. 역 유전학 바이러스학의 분야에서 큰 발전을이 끌고있다. 바이러스 성 게놈에 특정 수정 소개의 가능성 복제 및 RNA 바이러스의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하고있다. 이 기술은 수정 대상된 시리즈를 통해 특정 감쇄 함으로써 백신의 개발을 촉진 또한 크게 있다. 크게 바이러스 곱셈의 급속 한 정량화를 허용 하는 게놈 수정 개선 항 바이러스 검사 및 행동의 그들의 모드의 연구.

앞서 설명한 유전자 변형된 RSVs 취득 남아 있다 섬세 한. 여기, 우리는 프로토콜 각각 RSV GFP 또는 RSV-M2-1-GFP를 표현 하는 재조합 HRSV 두 가지 유형의 만들을 선발. 이 프로토콜에서 우리는 새로운 재조합 형 바이러스로 바이러스 주식 높은 titer, 재현성 실험에 적합을 얻기 위해 그들의 증폭을 구출 하는 데 필요한 transfection 조건 설명 합니다. 반전 유전학 벡터의 건설 라기보다 여기 설명 되지 않은입니다. 우리 할 최적의 수확 및 바이러스 성 주식의 동결에 대 한 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 전염 성 입자를 계량 하는 가장 정확한 방법은 패 분석 실험에 남아 있다. 셀 직렬 희석 분석 된 서 스 펜 션의 감염 되며는 상쾌한에 무료 바이러스 성 입자의 유포를 금지 하는 오버레이 함께 알을 품을. 이러한 조건에서 바이러스는 각 초기 전염 성 입자에 대 한 “패”를 형성 하는 인접 셀만 감염 됩니다. 기존 RSV 적정 분석 결과, 플 라크는 immunostaining에 의해 공개 하 고 현미경 관찰에서 계산. 이 메서드는 비싸고 시간이 많이 소요. 여기 우리는 육안으로 보이는 플 라크의 형성을 가능 하 게 미정 질 셀 루 로스 오버레이 사용 하 여 RSV 패 분석 결과 대 한 매우 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 측정 RSV 복제 하 고, 따라서, RSV GFP를 사용할 수 있습니다 어떻게 보여 antivirals의 영향을 계량화. 역 유전학 및 라이브 이미징 기술을 결합, RSV-M2-1-GFP 과학자 M2-라이브 셀에 1을 시각화 하 고 세포내 바이러스 구조, IBs 등의 역학 관계에 따라 있도록 하는 방법을 설명 합니다.