Isolatie van van vetweefsel afgeleide regeneratieve cellen voor de behandeling van erectiestoornissen na radicale prostatectomie

Alle in het protocol beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Deense nationale ethische commissie (nr. 37054), de Deense autoriteit voor gezondheid en geneesmiddelen (EUDRA-CT-nummer 2013-004220-11) en het Deense agentschap voor gegevensbescherming (2008-58-0035). De studie werd geregistreerd bij ClinicalTrials.gov (NCT02240823). De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki, gecontroleerd door de afdeling Good Clinical Practice (GCP) van het universitair ziekenhuis van Odense. ADRC-preparaat werd uitgevoerd in een erkende weefselinstelling voor de behandeling van menselijke weefsels en cellen in het universitair ziekenhuis van Odense (Deense autoriteit voor gezondheid en geneesmiddelen, vergunning nr. 29035). 1. Werving van patiënt/deelnemers Om deel te nemen aan de studie patiënten te werven die voldoen aan de volgende criteria voor inclusie. Rekruteer patiënten die ouder zijn dan 18 jaar, seksueel actief zijn vóór RP en niet zijn geïnfecteerd met de seksueel overdraagbare aandoeningen, bijvoorbeeld infectie met het humaan immunodeficiëntievirus, syfilis of hepatitis. Zorg ervoor dat ze last hebben van erectiestoornissen na een RP die werd uitgevoerd als gevolg van prostaatkanker.OPMERKING: In deze studie werden de patiënten 5-18 maanden na de RP geïncludeerd in de studie en werden ze opgenomen ongeacht de operatiemethode: open / robotondersteund of zenuwsparing / niet-zenuwsparing. Zorg ervoor dat de waarde van prostaatspecifiek antigeen (PSA) niet detecteerbaar moest zijn bij de klinische follow-up na de RP. Zorg ervoor dat patiënten seksueel actief waren vóór de RP en nog steeds de wens uitten om seksueel actief te blijven na de RP. Zorg ervoor dat farmacologische interventie met een fosfodiësterase type 5-remmer (PDE5-remmer ) of een synthetisch analoog van prostaglandine E1 (PGE1) is geprobeerd voordat u deelneemt en als onvoldoende wordt beschouwd. Zorg er verder voor dat de patiënten voldoende onderhuids vet op de buik of dij hebben. Sluit patiënten uit van het onderzoek, als er ernstige voorvallen waren onder de anesthesie tijdens de RP of als ze werden behandeld met anticoagulantia. 2. Liposuctie OPMERKING: Liposuctie is een operatie waarbij vet of lipocyten uit het onderhuidse gebied worden verwijderd. Dit deel van het protocol wordt uitgevoerd als een standaard liposuctie en de procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een operatiekamer. Alle instrumenten die onder de procedure worden gebruikt, moeten steriel zijn en de chirurg moet scrubs, steriele operatiejas, steriele handschoenen, chirurgisch masker en hoed dragen. Verdoof de patiënt. Zorg ervoor dat de patiënt tijdens de procedure onder algemene anesthesie staat en dit deel wordt uitgevoerd door een anesthesist. Desinfecteer de huid van de buik en het scrotum met chloorhexidine 0,5% (clorhexidine spirit, 96% ethanol gemedicineerd chloorhexidine digluconaat 77% W / W = 83% v / v). Gebruik een chirurgische marker om de gebieden op de buik te tekenen waar de liposuctie zal worden uitgevoerd. Het gebied zal meestal het gebied zijn tussen de symfyse en de navel. Maak twee 6 mm brede incisies in de huid van de buik met een scalpel (nummer 11). Plaats de incisies symmetrisch en lateraal vanuit het opgetrokken gebied van liposuctie. Doe een beetje glijmiddel zoals vaseline op de incisies, om ervoor te zorgen dat de infiltratiecanule tijdens de liposuctie gemakkelijk in en uit de incisies glijdt. Introduceer een maat 14 G infiltratie canule door de incisies in de huid. Injecteer gemodificeerde Kleins-oplossing subcutaan in de gemarkeerde gebieden parallel aan het huidoppervlak. Injecteer zoveel van de oplossing dat het beoogde weefsel gezwollen en stevig of tumescent wordt.OPMERKING: De gemodificeerde Kleins-oplossing bestaat uit een oplossing van 1.000 ml Ringers-lactaat en 1 mg adrenaline (epinefrine (1:1.000.000)). Gebruik geen lokale anesthesie voor de oplossing, omdat dit een negatieve invloed kan hebben op de ADRCs. Injecteer een volume gemodificeerde Kleins-oplossing dat overeenkomt met de verhouding 1:1 tot vetweefsel. Wacht 10 minuten om het effect van adrenaline te maximaliseren en de hoeveelheid bloed in geoogst vetweefsel te verminderen. Voer een standaard liposuctie uit met behulp van een jetinfusie liposuctie om 200-300 ml vetweefsel te oogsten. Gebruik stompe canules die hol zijn, waaraan een infuusbuis en een mondstuk zijn geïntegreerd. Bevestig de canule aan een zuigapparaat voor liposuctie.OPMERKING: Een continue ventilatorvormige waterinfusie maakt het vetweefsel los in fragmenten die gemakkelijk door de opening in de canule kunnen worden weggezogen. Breng een spuit van 3 mm met een stompe punt door de incisies op de buik Verzamel het vetweefsel in een lipo-collector om het lipoaspiraat in een steriele omgeving te bewaren. Het lipoaspiraat zal zich gaan afscheiden van de waterfase. Gebruik steriele spuiten van 50 ml om het lipoaspiraat uit de lipo-collector op te zuigen. Minimaliseer het volume water dat in de spuiten wordt opgezogen en schroef een plug op de punt van de spuiten om het vetweefsel steriel te houden. Plaats spuiten met punt naar beneden in een steriele plastic zak om de scheiding van lipoaspiraat van de waterfase te starten. Plaats de zak in een steriele container met de uiteinden naar beneden gericht om de scheiding voort te zetten. Bedek de container met steriel gordijn om de steriele omgeving tijdens het transport te beveiligen.OPMERKING: Volgens de gebruikershandleiding van de machine die voor de isolatie wordt gebruikt, kan het lipoaspiraat maximaal 4 uur vóór isolatie van de ADRCs worden opgeslagen, maar we verwerken het altijd onmiddellijk. Sluit de huidincisies met het gewenste hechtmateriaal van de chirurg. Plaats een compressiekledingstuk, een buikbindmiddel, rond de buik om het postoperatieve oedeem te verminderen. Maak een penisblok door 20 ml bupivacaïne 5 mg / ml met 5 μg adrenaline te injecteren. Gebruik een spuit van 20 ml en breng aan met een naald van 23 G, 1 1/4 inch lang. Breng 5 ml bupivacaïne aan in elk kwadrant in de subcutis. Injecteer de bupivacaïne op twee plaatsen, de ene ventraal geplaatst de andere dorsaal. Breng de naald over de gehele lengte in het onderhuidse weefsel en richt de naald zijdelings naar rechts en injecteer de anesthesie terwijl de naald wordt ingetrokken. Herhaal de injectie door de naald naar links te richten.OPMERKING: De patiënt kan nu door de anesthesist uit de algehele anesthesie worden gewekt. 3. Isolatie van ADRCs OPMERKING: Het isolatieproces van ARAC’s wordt uitgevoerd zoals in detail beschreven in de gebruikershandleiding na het apparaat (zie Tabel met materialen). Het is belangrijk dat de procedure onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het lipoaspiraat niet wordt blootgesteld aan verontreinigingen tijdens de zuivering van de ADRCs. De tijd die nodig is voor de isolatie van ADRCs hangt af van het volume lipoaspiraat, maar de hele procedure duurt ongeveer 2,5 uur met behulp van het semi-automatische apparaat zoals hier beschreven. Plaats alle verbruiksartikelen en enzymen aseptisch op een tafel bedekt met een steriele chirurgische wegwerphanddoek.OPMERKING: Een procedurekit bevat alle benodigde verbruiksartikelen en enzymen die nodig zijn voor de isolatie van ADRCs van één patiënt. Daarnaast moeten er drie 37-39 °C, één liter infuuszakken van Lactated Ringers beschikbaar zijn, samen met steriele kleding, handschoenen en handdoeken en ethanol voor desinfectie. Noteer alle lotnummers van verbruiksartikelen en enzymen en ook de temperatuur van de Lactated Ringers, wanneer aangesloten op het systeem. Veeg het apparaat af met ethanol en volg de instructies van de fabrikant Plaats de verbruiksartikelenset op het apparaat en sluit een zak lactated ringers aan op het systeem. Voer de reeks semi-automatische tests uit (systeemcontrole en lektest) voordat u het lipoaspiraat toevoegt. Laat het lipoaspiraat in buizen van 50 ml staan terwijl de stappen in 3.1 worden uitgevoerd. Hierdoor kan het vet zich scheiden van de vloeibare fase. Noteer de totale hoeveelheid (in ml) vetweefsel en gebruik dit om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid geladen vet binnen het bereik van de capaciteit van het apparaat ligt. Laad het weefsel wanneer het apparaat hierom vraagt. De machine zal nu overtollig vocht afvoeren en de hoeveelheid geladen vetweefsel wegen voordat deze wordt gewassen met lactated ringers. Wanneer het weefsel opnieuw is gewassen en uitgelekt, sluit u op verzoek van de machine een nieuwe infuuszak aan met 37-39 °C lactated ringers. Reconstitueer het in de handel verkrijgbare enzym dat collagenase en proteasemengsel bevat in 5 ml lactated ringers (één injectieflacon met enzym is voldoende voor vethoeveelheden tot 270 ml). Zorg ervoor dat het apparaat de hoeveelheid enzym weergeeft (op basis van het weefselgewicht) om met het vetweefsel in de bus te injecteren. Eenmaal geïnjecteerd, zal de enzymatische spijsvertering die wordt uitgevoerd onder agitatie ongeveer 20 minuten duren. Laat na de weefselvertering het roerwerk stoppen en controleer of de inhoud in twee fasen is verdeeld: een bovenste lipidebevattende, gele fase en een onderste roze laag die de ADRCs bevat. Laat de laatste laag afvloeien in de celverwerkingskamer (die in de ingebouwde centrifuge van het apparaat gaat) van de verbruiksartikelenset, terwijl de lipidelaag achterblijft. Laat ADRCs zich concentreren in de celverwerkingskamer tijdens meerdere centrifugatierondes. Voeg nu 10 ml Intravase toe (bevat DNase, dat helpt klonteren in de uiteindelijke ADRC-suspensie te voorkomen) gereconstitueerd in Lactated Ringers. De enzymatische reactie duurt 10 minuten waarna de ADRCs worden gewassen.OPMERKING: Deze stap is volledig automatisch en de machine zal informeren wanneer het proces is voltooid. Wanneer de isolatie van ADRCs is voltooid, resuspend de cellen in 5 ml Ringer Lactate. Zuig de oplossing op in een spuit van 5 ml. Monteer een 3-weg stopcock female Luer-lock op de 5 ml spuit met de ADRCs en zuig 4 ml ADRCs op in een andere steriele spuit van 5 ml. Breng de laatste 1 ml over in een spuit van 1 ml. Gebruik deze 1 ml voor ADRC-karakterisering, bijvoorbeeld celgetal, levensvatbaarheid van cellen, analyse van oppervlaktemarkers door flowcytometrie en ADRC-differentiatievermogen. Zet een naald van 25 G op de spuit van 5 ml met de 4 ml ADRC’s voordat deze in een steriel gordijn wordt verpakt. Gebruik de ADRCs voor injectie in de ontvanger. In dit geval bevat de oplossing van ADRCs gemiddeld 8,4-32,7 miljoen cellen. 4. Implantatie van de ADRCs in corpora cavernosum OPMERKING: Dit is een steriele procedure. Alle instrumenten moeten steriel zijn en de persoon die de oplossing met de stamcellen in het corpora cavernosum injecteert, moet steriele handschoenen dragen. De patiënt is wakker tijdens deze procedure en krijgt zijn eigen stamcellen. De ADRCs worden geïnjecteerd zonder de cellen te tellen voorafgaand aan de injectie. Houd de oplossing van ADRCs homogeen door de spuit voorzichtig te kantelen totdat deze in het corpora cavernosum wordt geïnjecteerd. Plaats een opening gedrapeerd over de penis. Plaats een tourniquet aan de wortel van de penis met behulp van een siliconen vatlus. Draai de lus aan en zet deze vast met een tang gebogen pean. Maak het tourniquet strak genoeg om de bloedstroom uit de penis te stoppen. Gebruik twee antiseptische swaps om de penishuid op de injectieplaats (laterale plaats van corpora cavernosum) te desinfecteren. Injecteer 1 ml van de oplossing die ADRCs bevat, in een directe hoek in het corpora cavernosum aan de rechterkant op twee verschillende plaatsen, herhaal deze stap daarna in het linker corpora cavernosum. Het totale volume geïnjecteerde ADRCs is 4 ml. Wacht 30 minuten en verwijder dan het tourniquet. Ontsla de patiënt na 2 uur observatie na de injectie van ADRCs, om ervoor te zorgen dat de patiënt goed hersteld is na de anesthesie. 5. Postoperatieve zorg Beveel de patiënt aan om geen fysieke prestaties te doen die de bloeddruk binnen de eerste week kunnen verhogen, om de ontwikkeling van hematomen te voorkomen. Beveel de patiënt aan om het abdominale bindmiddel de eerste 14 dagen na de operatie gedurende 24 uur te dragen en daarna gedurende 14 dagen overdag. Behandel postoperatieve pijn met orale paracetamol (bijv. Paracetamol; 1.000 mg, 4 keer per dag) en orale ontstekingsremmende (bijv. ibuprofen; 400 mg 3 keer per dag).