Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR

Espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules réactives ou des radicaux libres qui sont des sous-produits de la respiration aérobie (évaluée à ¹). Il s’agit de l’anion superoxyde, peroxyde, peroxyde d’hydrogène, radical hydroxyle et ions d’hydroxyle, entre autres. Dans des conditions physiologiques normales, ROS sont produites principalement par les mitochondries et les oxydases de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) et sont rapidement détoxifiés par diverses enzymes et protéines comme la superoxyde dismutase et de glutathion. Une production exagérée de ROS ou un défaut de la possibilité de supprimer les ROS peut entraîner un stress oxydatif, selon laquelle les espèces réactives de l’oxygène promouvoir les dégâts des protéines, les lipides et l’ADN entraînant stress cellulaire ou mort et les États pathologiques de la maladie. Cependant, on constate actuellement que ROS peut aussi servir de molécules de signalisation (signalisation redox) et ROS induite par la modification des différentes molécules et intermédiaires de la voie peut influer sur le métabolisme cellulaire, la prolifération, la survie, inflammatoire signalisation et le vieillissement². Dans les cellules phagocytaires, ROS joue un rôle essentiel en fournissant une activité antimicrobienne durant la soi-disant « burst respiratoire »^1,3,4,5,6. Au cours de la réaction des phagocytes à des stimuli externes, composants de la NADPH oxydase complexe (p40^phox, p47^phox, p67^phox) translocation du cytosol vers la membrane phagosome contenant la gp91phox et p22phox sous-unités, et avec les actions de Rac1/2, forment un entièrement fonctionnel NADPH oxydase complexe enzymatique. La NADPH oxydase Assemblée puis utilise NADPH pour réduire l’oxygène de superoxyde dans la vacuole phagosome. Les anions superoxyde peuvent causer directement des dommages ou être dismutated en peroxyde d’hydrogène. Superoxyde et peroxyde d’hydrogène peuvent réagir avec d’autres molécules pour générer des radicaux hydroxyles très réactifs. Dommage est médiée par la réaction de ces ROS avec les clusters fer-soufre sur des protéines ou en provoquant une base oxydation de l’ADN, conduisant finalement à métabolisme microbien restreint ou mort du microbe⁵. L’importance de l’enzyme oxydase de NADPH complexe et ROS produites pendant l’explosion respiratoire est illustrée sur le plan clinique chez les patients avec maladie granulomateuse chronique (CGD)^{7,8,9, 10}. individus avec DMC possèdent des mutations gp91phox, ce qui entraîne un manque de production de ROS et la susceptibilité aux infections récurrentes avec les bactéries et les champignons qui ne sont pas habituellement une préoccupation avec les individus immunocompétents. Par conséquent, si étudiant oxidative stress, signalisation redox ou défense de l’hôte, étant capable de mesurer la production de ROS en temps réel est un effort utile.

Plusieurs essais ont été utilisés pour la production de ROS de mesure ou les résultats du stress oxydatif^11,12,13. Parmi ceux-ci, un des plus couramment utilisé est la sonde fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC₂-DA)¹⁴. Cette molécule est incolore et lipophiles. Diffusion de DHFC₂-DA à travers la membrane de la cellule lui permet d’être commandés par des estérases intracellulaires, qui il deacetylates en DHFC_2, rendant la cellule imperméable. Les actions de plusieurs types de ROS (peroxyde d’hydrogène, peroxynitrite, les radicaux hydroxyles, oxyde nitrique et radicaux peroxy) sur DHFC₂ il s’oxyder en DCF qui est fluorescent (déclarés Ex / Em : 485-500 nm/515-530 nm) et peut être détecté à l’aide d’un flux cytomètre équipé d’un filtre standard défini pour la fluorescéine (FL1 canal). Superoxyde ne réagit pas fermement avec DHFC₂ mais elle peut réagir avec une autre sonde dihydroethidium (DHE) pour donner le produit fluorescent 2-hydroxyethidium (ainsi que d’autres produits d’oxydation de superoxyde indépendant fluorescent)¹⁵. Les produits fluorescents d’oxydation DHE peuvent être détectés à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 518 nm et une longueur d’onde d’émission de 605 nm (FL2 canal). Bien que relativement simple d’utilisation, utilisation de ces sondes de détection de ROS nécessite une connaissance de leurs limites et intégration minutieuse de coloration des procédures et des contrôles dans le dosage spécifique en cours afin d’avoir valide expérimentale résultats et conclusions. Le protocole suivant illustre l’utilisation d’un kit disponible dans le commerce qui emploient ces 2 sondes conçues pour mesurer les ROS par cytométrie en flux. Nous avons tache apprêtées macrophages dérivés de la moelle osseuse avec ces sondes et induire la production de ROS par réticulation FcγR. Nous présentons des données représentatives obtenues à l’aide de ce protocole et insister sur les précautions appropriées doivent être entrepris dans une expérimentation réussie.