FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

活性酸素種 (ROS)、反応分子または (文献¹) 好気性の呼吸の副産物であるフリーラジカルです。これらには、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、他の中の水酸イオンが含まれます。通常の生理学的な条件の下で ROS は主にミトコンドリアとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH) 酸化酵素によって生成され、様々 な酵素、スーパーオキシドディスムターゼやグルタチオンなどのタンパク質によって急速に無害化します。活性酸素や活性酸素を除去する能力に欠陥の誇張された生産は、酸化ストレス、活性酸素種がタンパク質、脂質、および病理学的病気の状態や死細胞ストレスにつながる DNA の損傷を促進するというで起因できます。しかし、それは現在感謝 ROS も (レドックスシグナ リング)、シグナル分子として機能し、様々 な分子および経路の中間体の活性酸素を介した変更に影響を与える細胞の代謝、増殖、生存、炎症性シグナル伝達と²を老化します。貪食細胞では、ROS は、いわゆる「呼吸バースト」^1,3,4,5,6時に抗菌活性を提供する重要な役割を果たしています。外部刺激に食細胞の応答、時に NADPH オキシダーゼ複合体 (p40^phox、p47^phox、p67^phox) のコンポーネントは gp91phox と p22phox 含む phagosomal 膜に細胞質から、若しサブユニット、Rac1/2 のアクションと共に完全に機能 NADPH オキシダーゼ酵素複合体を形成します。組み立ての NADPH オキシダーゼ、スーパーオキシド phagosomal 液胞内に酸素を減らす NADPH を利用しています。スーパーオキシドの陰イオンは、直接破損したり、過酸化水素に dismutated。スーパーオキシドと過酸化水素は、反応性の高いヒドロキシラジカルを生成する他の分子と反応できます。被害は、タンパク質の鉄硫黄クラスターとこれらの ROS の反応、dna の制限の微生物代謝または微生物⁵の死に最終的につながる基本の酸化を引き起こすことによって媒介されます。NADPH オキシダーゼ酵素の複合体の重要性と呼吸バースト中に生成された ROS は慢性肉芽腫症 (CGD)^7,8,9,の患者で臨床的に示されて¹⁰. CGD を持つ個人は、活性酸素産生や細菌および真菌は通常免疫の個人の関心事の再発性感染症への感受性の欠如の結果 gp91phox、変異を持っています。したがって、勉強を測定することができる酸化ストレス、レドックス シグナル、または宿主防御されてかどうかリアルタイムでの活性酸素産生は有用な試みです。

複数のアッセイは、メジャーの活性酸素産生や酸化ストレス^11,12,13の結果に利用されています。これらのうち、最も広く使用されるの 1 つは蛍光プローブ 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH₂-DA)¹⁴です。この分子は無色と脂溶性です。DCFH₂– da セル膜を渡る拡散できます、細胞内エステラーゼによって速やかに DCFH_2、不浸透性セルを表示にナミズムします。DCFH₂ ROS (過酸化水素、ペルオキシ ナイト ライト、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、ペルオキシラジカル) の複数の種類のアクションは蛍光である DCF にそれを酸化 (Ex 報告/Em: 485-500 nm/515-530 nm)、フローを使用して検出することができますcytometer フルオレセイン (FL1 チャネル) の設定標準フィルター搭載します。スーパーオキシドは、DCFH₂と強く反応しないが、製品は、蛍光 2 hydroxyethidium (同様に他の蛍光活性酸素に依存しない酸化生成物)¹⁵を生成する別のプローブ dihydroethidium (DHE) と反応することができます。518 の励起波長を用いた蛍光 dhe は酸化物を検出できる nm、発光波長 605 nm (FL2 チャネル)。身の程の知識と実験に有効があるために実行されている特定の測定手順とコントロールを染色の注意定款に ROS の検出用のプローブの使用率が必要ですを使用する比較的簡単ですが、結果と結論。次のプロトコルは、フローサイトメトリーによるロスを測定するように設計これらの 2 のプローブを用いた市販のキットの使用を示します。我々 はこれらのプローブでプライミング骨髄由来マクロファージを染色、FcγR 架橋による活性酸素産生を誘導します。このプロトコルを使用して得られた代表的なデータを提示し、成功した実験を実施する必要があります適切な予防措置を強調.