Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn reactieve moleculen of vrije radicalen die een van aërobe ademhaling bijproduct (herzien in ¹). Het gaat hierbij om de superoxide anion, peroxide, waterstofperoxide, hydroxyl radicaal en hydroxyl ionen, onder anderen. In normale fysiologische omstandigheden ROS worden vooral door de mitochondriën en nicotinamide adenine dinucleotide-fosfaat (NADPH) oxidasen geproduceerd en zijn snel door verschillende enzymen en eiwitten zoals superoxide dismutase en glutathion voorkomt. Een overdreven productie van ROS of een defect in de mogelijkheid om te verwijderen van ROS kan resulteren in oxidatieve stress, waarbij reactieve zuurstof soorten bevorderen de schade van eiwitten, lipiden en DNA leidt tot cellulaire stress of dood en pathologische ziekte staten. Echter is het op dit moment gewaardeerd dat ROS ook als signalering moleculen (redox signalering fungeren kan) en ROS-gemedieerde wijziging van verschillende moleculen en traject tussenproducten cellulaire metabolisme, proliferatie, overleving, inflammatoire beïnvloeden kan signalering en veroudering van². In fagocytische cellen speelt ROS een essentiële rol bij het verstrekken van antimicrobiële activiteit tijdens de zogenaamde “respiratoire burst”^1,3,4,5,6. Tijdens de reactie van fagocyten op externe prikkels translocate onderdelen van de NADPH oxidase complexe (p40^phox, p47^phox, p67^phox) van het cytosol aan de phagosomal membraan met de gp91phox en p22phox subeenheden, en samen met de acties van Rac1/2, vormen een volledig functionele NADPH oxidase enzym complex. De geassembleerde NADPH oxidase maakt vervolgens gebruik van NADPH ter vermindering van zuurstof tot een superoxide binnen de phagosomal vacuole. Superoxide anionen kunnen direct schade veroorzaken of worden dismutated in waterstofperoxide. Zowel superoxide en waterstofperoxide kunnen reageren met andere moleculen voor het genereren van zeer reactieve hydroxyl radicalen. Schade is bemiddeld door reactie van deze ROS met ijzer-zwavel clusters op eiwitten of door het veroorzaken van base oxidatie van DNA, uiteindelijk leidde tot beperkte microbiële metabolisme of dood van de microbe⁵. Het belang van het NADPH oxidase enzym complex en ROS geproduceerd tijdens de respiratoire burst wordt klinisch geïllustreerd in patiënten met chronische granulomateuze ziekte (CGD)^{7,8,9, 10}. personen met CGD bezitten mutaties in gp91phox, wat resulteert in een gebrek aan ROS productie en gevoeligheid voor terugkerende infecties met bacteriën en schimmels die meestal niet een punt van zorg met immunocompetent individuen zijn. Daarom, of studeren oxidatieve stress, redox signalering of host defense, in staat zijn om te meten ROS productie in real time is een nuttig inspanning.

Meerdere testen hebben gebruikt maatregel ROS productie of de resultaten van oxidatieve stress^11,12,13. Daaronder is een van de meest gebruikte de fluorescerende sonde 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH₂-DA)¹⁴. Dit molecuul is kleurloos en lipofiele. Verspreiding van DCFH₂-DA tussen de celmembranen kan hij worden opgevolgd door intracellulaire esterasen, die het deacetylates in DCFH_2, waardoor zij cel ondoordringbare. De acties van meerdere soorten ROS (waterstofperoxide, peroxynitriet hydroxyl radicalen, stikstofmonoxide en peroxy radicalen) op DCFH₂ het oxideren in DCF dat tl is (gerapporteerde Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) en kan worden opgespoord met behulp van een stroom cytometer uitgerust met een standaard filter instellen voor fluoresceïne (FL1 kanaal). Superoxide niet sterk reageert met DCFH₂ maar met een andere sonde dihydroethidium (DHE) opbrengst van de fluorescerende product 2-hydroxyethidium (evenals andere producten van fluorescerende superoxide-onafhankelijke oxidatie)¹⁵kan reageren. De fluorescerende producten van DHE oxidatie kunnen worden opgespoord met behulp van een golflengte van de excitatie van 518 nm en een golflengte van de emissie van 605 nm (FL2 kanaal). Hoewel het relatief eenvoudig te gebruiken, vereist gebruik van deze sondes voor detectie van ROS kennis van hun beperkingen en zorgvuldige opneming van kleuring procedures en controles in de specifieke bepaling wordt uitgevoerd om geldige experimentele resultaten en conclusies. Het volgende protocol demonstreert het gebruik van een commercieel beschikbare kit deze 2 sondes voor het meten van ROS ontworpen door stroom cytometry in dienst. We primer beenmerg-afgeleide macrofagen vlek met deze sondes en veroorzaken ROS productie via het FcγR dwarsbinding. Wij presenteren representatieve gegevens verkregen met behulp van dit protocol en wijzen passende voorzorgsmaatregelen die moeten worden ondernomen voor succesvolle experimenten.