높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

이 프로토콜 WRAIR 인간 주체의 보호 위원회의 지침을 따릅니다. 이 연구에 사용 된 샘플 WRAIR 프로토콜 번호 1328, 인간을 대상의 보호 통치 모든 기관 및 연방 규정을 준수의 일환으로 수집 하는 인간의 혈 청 샘플 있습니다. 샘플 드 식별, 그리고 이러한 익명 샘플 사용 UAB IRB (프로토콜 번호 N150115001)에 의해 비 인간 대상 연구로 분류 되었다. 1. 분석 결과 시 약 준비 1% 준비 물 100 mL에 젤라틴의 1 g을 추가 하 여 젤라틴. 오토 클레이 브 그리고 실내 온도에 상점입니다. 준비 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium 염화) 재고 솔루션 (1, 000 x) 40 mL 물에 TTC의 5 g을 추가 하 여. TTC 완전히 해산 때 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 살 균 필터와 물 50 mL를 볼륨을 조정 합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.참고: TTC는 세균성 식민지 색을 지정 하 고 그들을 훨씬 쉽게 계산 하. TTC 솔루션은 약간의 노란색. TTC 솔루션 개발은 붉은 색, 삭제 하 고 신선한 준비. 물 40 mL에 5 g 앤3 을 추가 하 여 10% 나트륨 아 지 드 (NaN3) 재고 솔루션 (100 x)를 준비 합니다. 완전 한 해체 후 물 50 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 상점.주의: 나트륨 아 지 드 독 이며, 섭취 또는 피부 또는 눈을 통해 흡수 하는 경우 독성이 있을 수 있습니다. 그것은 리드와 높은 폭발성 금속 azides를 구리 배관 반응 수 있습니다. 나트륨 아 지 드를 포함 하는 시 약의 처분, 아 지 드 형성을 방지 하거나 생물 가방에 무시 하는 물의 큰 볼륨 플러시. 물과 압력솥의 1 l 파운드 agar의 35 g를 추가 하 여 LBA 플레이트 (파운드 천 배지)를 준비 합니다. 각 광장 페 트리 접시 (120 x 120 m m2) 25 mL를 추가 합니다. 접시를 공고히 한 천 수 있도록 10-20 분에 대 한 RT에서 품 어. 최대 1 개월에 대 한 비닐 봉지와 4 ° C에 저장소에 다시 접시를 놓습니다. 물과 압력솥의 1000 mL를 agar의 7.5 g을 추가 하 여 중첩 Agar를 준비 합니다. 56 ° C 물 목욕까지 필요에서 품 어. 바로 사용 하기 전에, 100 mg/mL TTC와 10 mL의 1 mL을 추가 10% 할머니3 와 섞어 잘.참고: 각 LBA 판 오버레이 Agar의 25 mL이 필요합니다. 오버레이 한 천 1 개월 사전에 준비 하 고 분석 결과 대 한 필요에 따라 전자 레인지 나 핫 플레이트에 녹아 수 있습니다. 천이 온도 LBA 판 응용 프로그램 전에 ~ 55 ° C 인지 확인 합니다. 물 40 mL에 5 mL의 10 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 캘리포니아2 +/Mg2 + 와 1% 젤라틴의 5 mL을 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 실내 온도에 상점. 2. 준비 보완 및 박테리아를 대상 준비 아기 토끼 보완 (BRC)참고: 기준 보완 많은 선택을 찾을 수 있습니다 여기에 대 한 자세한: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf BRC 냉동된을 녹여 냉 수를 실행 합니다. 물리적으로 혼합 된 BRC 마다 10 ~ 20 분 완전히 해 동 때까지. BRC 반복된 동결 해 동 주기를 적용 하지 마십시오. BRC 녹고 동안 1.5 mL 이나 5 mL, 15 mL 원심 분리기 튜브 라벨. 장소 표시를 미리 냉각 얼음에 튜브. 사전 냉각된 원심 분리기 튜브에 aliquot 적절 한 볼륨 BRC (작성 후 즉시 반환 각 튜브는 얼음에). Aliquots ≤-70 ° C에서 냉동 실에 저장 합니다.참고: 보완의 약 1 m 각 분석 결과 접시 필요 합니다. 보완 aliquots 싱글 이며 aliquoted 레이아웃 분석 결과에 적합 한 볼륨에 있어야 합니다. 열 비활성화 BRC를 준비 하려면 활성 BRC의 한 약 수 동. 56 ° C 물 목욕을 준비 합니다. BRC 완전히 해 동 후 물 목욕을 전송 하 고 30 분 동안 품 어. 부 화, 후 물 목욕에서 열 비활성화 BRC 제거 하 고 10-15 분 믹스에 대 한 적극적으로, RT에 시원한 수 그리고 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 aliquot ~ 150 µ L. 저장 ≤에 aliquots-10 ° c. 준비 대상 박테리아 주식참고: 다음 절차의 대상 박테리아; 48 aliquots를 준비 하는 더 많은 aliquots가 필요한 경우 프로토콜 확장할 수 있습니다. 마스터는 냉장고에서 유리병 주식과 혈액 한 천 배지 위에 유리병에서 얼음의 작은 금액을 제거 하는 냉동된 세균성 표면 긁어 박테리아를 제거 합니다. 즉시 냉동 실에 마스터 재고 유리병을 반환 합니다. 혈액 한 천 배지와 접시 뚜껑 덮개에 세균 재고의이 작은 약 수 행진 품 어 접시 거꾸로 하룻밤 37 °C/5% CO2 배양 기에서. ~ 10 격리 된 부드러운 식민지 파운드 국물의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송. 문화 국물 ~0.6 0.7의600 세 때까지 부드럽게 흔들어 37 ° C에서 3-5 h에 대 한 품 어. 최고 12.5 mL 문화와 신선한 50 mL 튜브에 수확. 문화는 탁상용 마이크로 원심 분리기를 사용 하 여 2 분 동안 15000 x g 에서 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시 15% 살 균 글리세롤-파운드 25 mL에 펠 릿을 일시 중단. 잘 혼합 하 고 0.5 mL aliquots 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 (~ 48 튜브)로 분배. Aliquots ≤-70 ° C에서 냉동 실에 저장 합니다. 사용 하기 전에 교착 테스트를 사용 하 여 세균성 id를 확인 합니다. 대상 박테리아 주식에 대 한 최적의 희석 비율의 결정참고: 각 일괄 처리 대상 박테리아의 희석 ~ 120 CFU/파운드 플레이트에 자리를 양보 하는 데 필요한 결정 하기 위해 시험 조건에서 적정 해야 합니다. 결정 플레이트 (희석 플레이트) 고 1A를 잘 분석 결과 버퍼의 135 µ L을 추가. 분석 결과 버터 120 µ L를 웰 스 1B-1 시간 추가. 냉장고에서 냉동된 대상 박테리아의 유리병을 제거 하 고 실 온에서 해 동. 1A 세균 주식의 10 희석 수 있도록 잘 해 동 세균성 주식 15ul을 추가 합니다. 5 직렬 희석을 수행 하기 위해 잘 1b 잘 1A에서 30 µ L 세균성 솔루션의 전송. 8 희석 (1시 10분, 1시 50분, 1: 250, 250 1:1; 250 1:6; 250 1: 31; 250 1: 156, 1:781 250)의 총에 대 한 1 시간을 잘 5 직렬 희석을 계속 합니다. 다른 결정 플레이트 (분석 결과 플레이트) 하 고 열 1과 2는 시험 접시에 모두 잘 분석 결과 버퍼의 20 µ L를 추가. 1과 2는 시험 접시의 열에 해당 우물에 각 잘 희석 플레이트의 열 1에서에서에서 희석된 박테리아의 10 µ L를 전송. 박테리아의 10 µ L 잘 1A와 2A 분석 결과 접시, 등으로 희석 판의 잘 1A에서 전송 됩니다. 분석 결과 A 컨트롤과 컨트롤 B 단계 3.6-3.12에 혈 청 살 균 분석 결과 (SBA) 아래 설명 된 대로 계속 합니다. 판 얼음에 인 큐베이 팅 되었습니다, 후 LBA 플레이트에 열 1에 있는 우물에서 10 µ L 자리 8 피 펫 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 합니다. 또한, LBA 플레이트에 열 2에서에서 우물 자리. 3.14-4.6 단계에서 아래와 같이 분석 결과 함께 계속. 결정 제어 b에서 ~ 120 CFU/자리 생성 박테리아 희석,이 희석 분석 결과에 사용 됩니다. 3. 혈 청 살 균 시험 (SBA) 참고: 아래 설명 된 절차 한 분석 결과 접시, 하지만 분석 결과 접시의 수를 늘릴 수 있습니다. 30 분 동안 56 ° C 물 욕조에 잠복기 샘플에는 샘플을 테스트 열 비활성화.참고: 테스트 샘플은 어떤 생 보완 활동 폐지를 테스트 하기 전에 열 비활성화 되어야 합니다. 이 분석 결과 앞서 행 해질 수 있다 고 사 샘플을 다시 동결 또는 테스트 때까지 4 ° C에서 저장 수 있습니다. 분석 결과 플레이트 및 추가 분석 결과 버퍼의 20 µ L 열 1 행의 A G. 추가 20 µ L 통해 분석 결과 버퍼의 열 1과 2 행 H의 12, 표 1을 참조 하십시오. 중복 행 H 분석 결과 접시의 각 테스트 샘플의 30 µ L을 로드 합니다. 예를 들어 3 H, 4 H, 웰 스에 샘플 1의 30 µ L를 분배 하 고 웰 스 H 5와 6 H 등으로 30 µ L 샘플 2의 분배. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 테스트 샘플의 3 연속 희석을 수행 합니다. 행 G 10 우물 3-12 시에서에서 샘플의 μ와 해당 웰 스 전송 제거 하 고 잘 아래로 pipetting으로 샘플을 혼합 8-10 시간. 다음 행 F 10 우물 3 G-12 G에서에서 μ와 해당 우물에 제거 하 고 잘 혼합. 계속 행 A. 통해 직렬이 희석 혼합 후 행 A 우물, 제거 하 고 모든 웰 스 포함 20 µ l 우물 3A-12A에서 10 µ l를 삭제 합니다.참고: 혈 청의 20 µ L 80 µ L의 분석 결과 전체 볼륨에서 사용 되, 분석 결과에 4-fold 추가 희석이입니다. 이 희석 혈 청 희석 4를 곱하여 SBA titer의 계산 하는 동안 계정에 촬영 해야 합니다. 예를 들어 1: 2의 시작 희석을 사용 하는 경우 테스트 중인 실제 희석 1:8입니다. 냉동된 대상 박테리아 재고와 실 온에서 해 동 한 유리병을 제거 합니다. (이 희석 요인은 섹션 2.3결정 했다) 미리 정해진된 최적의 희석 요인에 따라 분석 결과 버퍼의 20 mL에 박테리아를 희석. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 희석된 박테리아의 10 µ L를 추가 합니다. 또는 제거 냉동된 BRC의 한 유리병과의 한 유리병 열 비활성화 BRC, 냉 수를 실행을 실 온에서 해 동 냉동 해 동 신속 하 게 공기를 불어 캐비닛 생물 안전의 창 살에 장소. 열 비활성화 BRC의 20% 솔루션을 준비 합니다. 믹스 100 µ L 열 비활성화 BRC의 분석 결과 버퍼의 400 µ L와. 열 1 (제어 A 우물)에 있는 모든 우물에이 20% 열 비활성화 BRC 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.참고: 열 비활성화 BRC 분석 결과에서 일반적인 살인 (NSK)를 모니터링 하는 제어로 사용 됩니다. 네이티브 BRC의 20% 솔루션을 준비 합니다. 분석 결과 버퍼의 4 mL와 함께 네이티브 BRC의 1 mL를 혼합. 열 2 12 (제어 B와 테스트 샘플 우물)-모든 우물에이 혼합물의 50 µ L를 추가 합니다.참고: 반응 혼합물에서 BRC의 최종 농도 12.5%입니다. 짧게 분석 결과 플레이트 판 통에 10-15 s 부드럽게 흔들어 혼합 또는 8 배 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 혼합. (흔들어) 없이 분석 결과 플레이트 37 ° C 2 h에 대 한 미생물 배양 기에 넣어. 건조 2 LBA 판 뚜껑을 제거 하 고 접시를 배치 하 여 생물 안전 캐비닛 40-60 분에 직면 하 고. 2 h 부 화 완료 되 면 얼음을 젖은 반응을 중지를 10-20 분 동안 품 어을 분석 결과 접시를 이동 합니다. 12 채널 피 펫을 사용 하 여 행 H, 및 LBA 판의 하단에 반응 혼합물의 자리 접시 10 µ L에서 웰 스 믹스. 즉시 접시를 기울기 고 ~1.5-2 cm. 행 G, F, E, LBA 접시에 이전 행 위에 그들을 야생에 대 한이 절차를 반복에 대 한 실행을 관광 명소. 행 E, F, G 및 H LBA 플레이트, 및 행 A, B, C 및 D는 같은 방식으로 두 번째 LBA 접시에 발견 한 발견은 그림 1을 참조 하십시오. 솔루션은 LBA 접시 (10-15 분)으로 흡착 될 때까지 실 온에서 LBA 접시를 품 어. LBA 접시에 뚜껑을 넣고 밤새 품 어를 거꾸로 미생물 인큐베이터에서 LBA 판 배치 (16 ~ 18 h). S. flexneri 2a, 3a 29 ° C에서 품 어와 품 어 S. sonnei 는 26 ° c.에참고: 이 온도 더 작은 “마이크로-식민지” 식민지 카운터9에의해 정확한 계산을 위해 적당 한 크기와 항복. 하룻밤 부 화 후 25 mL 오버레이 Agar의 (~ 55 ° C)에서 포함 하는 100 µ g/mL TTC와 0.1% 할머니3 각 LBA 접시에 추가 합니다. LBA 판 붉은 색 개발 아래 그림 1 을 참조 하십시오 살아남은 박테리아 수 있도록 2 h 37 ° C에서 품 어. 사진 디지털 카메라를 사용 하 여 접시와 NIST의 통합된 식민지 열거 소프트웨어 (니스)가 설치 된 컴퓨터에 이미지를 전송 그림 2를 참조 하십시오.참고: 멋진 식민지-세 소프트웨어 비용 없이 이용하실 수 있습니다. 세부 사항 및 설치 지침에 대 한 자료 목록 참조. 4. 수 세균성 식민지 오픈 좋은 소프트웨어 및 입력된 연산자 이름, 실험 정보 및 모든 빈 필드에 메모 를 시험. 이 데이터 입력 되 면 완료 단추를 클릭 합니다. 열기 단추를 클릭 하 고 컴퓨터에서 올바른 파일을 선택 하 여 촬영된 번호판을 가져옵니다. 12의 열 수와 4 행 의 수를 설정 하 여 분석 결과 매개 변수를 조정 합니다. -3 시그마 배경 설정과 낮은 해상도 조정 합니다. 그림 2를 참조 하십시오. 클릭 하 여 각 ROI는 직접 한 샘플 자리를 관심사 (ROIs)의 영역을 이동 합니다. 모든 세균성 식민지 샘플 사이 아무 중복 투자 수익 내는 확인 하십시오. 한 접시 완료 되 면 저장 데이터 이미지 목록에서 다음 접시를 두 번 클릭 하 고는 ROIs를 조정 합니다. 그림 2를 참조 하십시오. 모든 접시 조정 되었습니다, 녹색 수 버튼을 클릭, 그림 2 및 그림 3참조. 완료 되 면 세.xls/.xlsx 형식에서 데이터를 내보내려면 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 이름 하 고 데이터 분석에 대 한.xls/.xlsx 파일을 저장 합니다. 조사 분석 결과 96 잘 접시를 나타내는 테이블에 구성 됩니다 있도록 테이블 형식으로 데이터를 내보낸, 참조 표 2. 5. SBA Titer (기) 및 비 특정 살인 (NSK) 계산 참고: SBA titer, 또는 살인 인덱스 (반) 대상 박테리아의 50%를 죽이 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다. 활성 보완 제어 우물 (제어 B)의 CFU를 평균 하 고 2로 분할 하 여 인덱스 (기) 컷오프 값을 죽이고 50%를 계산 합니다. 각 희석 중복에서 실행 하는 각 샘플에 대 한 평균 CFU 계산 표 3을 참조 하십시오. 혈 청 희석 거의 정확 하 게이 50% 기 값을 얻을 것입니다, 때문에 그것은 두 개의 순차적 혈 청 희석, 살인 보다는 더 적은 50%와 50% 이상 죽이에서 보간 수 있습니다 그림 4를 참조 하십시오. 보간된 SBA 기 계산을 위한 공식은 아래와 같습니다.참고: 살 균 titer, 또는 기, 또한 UAB에서 개발한 Opsotiter 소프트웨어를 사용 하 여 자동으로 계산할 수 있습니다. 요청 Opsotiter 박사 문 남 또는 씨 롭 버튼 문의. 연락처 정보에 대 한 https://www.vaccine.uab.edu를 참조 하십시오. 제어 B 컨트롤 a.의 평균으로 나눈 값의 평균을 뺀 1을 복용 하 여 NSK 값 계산