一种用于阴南芥叶片安装的通用方法

注: 在延时成像过程中, 防止活叶样本的睡眠运动是很重要的。为了最大限度地减少对树叶的机械应力, 必须对叶子进行温和的固定。只有充分准备的叶片样品才能产生适合各种图像分析的延时图像。一种利用转基因拟南芥植物在pr1基因启动子 (ppr1-yfp-nls 植物) 和注射假单胞菌的控制下表达 yfp-nls融合的方案。番茄酱dc3000 (avrpt2) 应变 (Pst_a2) 是下面的一个例子。 1. 植物和病原体的制备 用蒸压土填充塑料电池塞盘 (材料表)。 每个细胞播种一个转基因拟南芥种子 (图 1a)。 将托盘转移到保持在23°c 的生长室, 并在连续白光下种植2-3周。 在病原体接种前两天, 条纹注射器假单胞菌。番茄酱从甘油库存到纽约介质 (5gl 肽) 的 dc3000 avrpt2菌株 (Pst_a2), 3 gl 酵母提取物, 20 mll 甘油, 15 gml 细菌学, ph 7.0), 含有 100 mg/l 利福平和 50 mg l 卡霉素, 在28°c 孵育48小时。 用塑料尖端收集出现在培养基表面的细菌细胞, 将其转移到含有 10 mm mgcl2的塑料管中, 然后重新悬浮。以600纳米 (od 600) 的速度测量溶液的光学密度 (od)。将细菌细胞的最终细胞浓度调整为 10个 8个菌落形成单元 (cfu)/ml, 通常相当于 od600 = 0.2 11. 2. 病原体接种 小心地剪下一个细胞插头, 里面有一个2-3周的工厂, 而不会损坏植物。将电池设置在空单元插入式托盘中 (2 x 2 单元就足够了), 以保持良好的平衡 (图 1b)。 选择一个明显健康的叶子进行接种。一般来说, 从植物底部的第三、第四和第五叶 (#3、#4 和 #5, 分别如图 1c) 很容易处理。在一组实验中使用同一位置的叶子, 以获得更好的重现性。在接种前给抱着植物的土壤浇水, 以便进行长期延时成像。 或者, 在分析抗压反应促进剂 (如 ppr1)的情况下, 为了确保植物不会自然受到压力, 在病原体接种之前检查荧光立体显微镜下的叶子, 以验证是否没有 yfp 信号。排除实验中显示 yfp 信号的叶子。 在渗透前戴上一次性乳胶手套, 避免与病原体直接接触。使用1毫升无针塑料注射器, 用细菌悬浮液 (108 cfuml) 11 (图 1d)仔细浸润叶片的背面。在一半的叶子上接种一小部分, 可以很好地显示ppr1的活性;与剩余的叶子相比, 浸润的区域在颜色上变得更深的绿色。在渗透过程中, 要非常小心, 不要对叶子造成任何机械损坏。注: 确保浸润区域中的所有细胞间空间完全 (垂直) 与病原体悬浮液一起完成;否则, pcd 域将很难在荧光立体显微镜下可视化。这可以简单地通过在浸润区域完成黑暗绿化来证实。 用软纸巾从浸润叶片浸润段周围吸收多余的细菌悬浮液。 3. 安装接种的叶子 接种后, 立即使用手术胶带 (材料表) 将玻璃滑块固定在塑料托盘上, 使浸润的叶子位于玻璃滑块的中心。确保接种的叶片完全安装在玻璃滑块内 (图 2a)。 准备双层塑料胶带 (在0.2 毫米厚的胶带的情况下, 见材料表), 并将其切割成两片 (图 2b; 片1和 2), 以适应沿浸润叶片的叶柄的空间。排列这两个部分的长度,用图 2b中的双向箭头表示, 以适应图 2a 所示的双向箭头的长度。注: 从两个部分中的每一个角落剪掉一个角落有助于避免对叶片造成损坏 (图 2b, 箭头; 另见下面的步骤 3.4)。任何一种厚度相似的塑料胶带都适合在叶柄上做一座桥。在下面描述的过程中, 塑料胶带的刚度对于易于操作非常重要。 使用一对精细的推子, 将胶带件1和2粘在叶柄的两侧, 使每一块的切角与叶片的底部对齐 (图 2c)。确保胶带片不接触叶柄或叶片。注: 这些双层塑料胶带件在叶片的底部作为间隔, 并防止物理应力在叶柄在安装过程中。 准备另一块双层塑料胶带 (图 2b, 一块 3), 以适应图2 b 中双向箭头的大小, 并将其贴在胶带件1和2的顶部, 形成一个桥在叶柄(图 2d, e)。要非常小心, 不要直接抓住叶柄和叶片之间的磁带件在图2d, e中箭头指示的位置。 轻轻地将一小块手术胶带 (图 2f, 一块 4) 贴在叶片尖端上方的玻璃滑梯上, 使叶片非常柔软地固定在玻璃滑梯上。只需牢固地按下直接接触玻璃滑梯的手术胶带部分 (图 2f, 用虚线勾画的区域), 而不是覆盖叶子的另一部分。 轻轻地将另一小块手术胶带 (图 2g, 一块 5) 贴在叶柄和塑料胶带片 (1, 2 和 3) 的边界上, 使叶柄非常柔和地固定在玻璃滑梯和塑料胶带片上。仅牢固地将直接接触玻璃滑块的部分连接到玻璃滑梯和塑料胶带件上 (图 2g, 用虚线概述的区域), 而不是在叶柄上的另一部分。 防止相邻的叶子使用200μl 移液器吸头进入显微镜的视场 (图 2h)。将移液器吸头插入土壤中, 轻轻地将相邻的叶子从浸润的叶子上固定起来。注意不要在土壤中插入过深的尖端, 以免根部受损。注: 制备的植物现在已准备好进行荧光立体显微镜成像。 4. 微观延时观测 打开荧光立体显微镜。注: 在这里, 使用的是配备了高度敏感的140万像素单色单色数码相机在12位模式下的自动立体显微镜 (材料表)。显微镜应放置在装有空调装置的黑暗房间或通风良好的黑暗柜子中, 以便在延时成像期间将室温保持在23°c。 将植物放置在上面空间的立体显微镜的物镜下进行成像。 设置延时成像的参数 (请参见表1中的示例)。确保在延时成像的间隔期间对光线照射步骤进行编程, 因为光线对植物免疫有重大影响. 使用传统的 yfp 滤波器 (励磁500-520 纳米; 发射 500-520 nm) 可视化 yfp 信号。 使用 texas red (txr) 滤光片 (激发 540-580 nm; 发射 610 nm 长通) 可视化叶绿素自体荧光, 以便 pcd 域可以看到作为一个黑暗区域 (无自荧光), 周围有 yfp 阳性细胞层 9 (图 3)a)。 使用传统的自我明亮的现场设置来执行额外的光曝光步骤。注: 实验前, 测量信亮光源的功率, 并将其调整到自己的植物生长条件水平。 运行延时成像程序。对于几天的长期观察, 考虑对植物进行适当的浇水, 例如, 在光暴露步骤中。 在图像采集后, 在数据集中的时间间隔 (对应于表1中的通道 3-8) 中省略用于光线照射的额外通道。使用不同的图像分析软件 (如斐济 9), 使用各种方法 (如感兴趣区域(roi) 分析) 分析数据。