Vi præsenterer her, en protokol for fortløbende målrettede kvantificering og ikke-målrettet analyse af fluorholdige forbindelser i vand ved massespektrometri. Denne metode giver kvantitative niveauer af kendte fluorochemical forbindelser og identificerer ukendte kemikalier i beslægtede prøver med semi-kvantitative skøn over deres overflod.
Historiske og nye per- og polyfluoroalkyl stoffer (PFASs) har vundet betydelig interesse fra de offentlige og offentlige institutioner fra lokalt til føderale niveauer. Den fortsatte udvikling af PFAS kemi er en udfordring til miljøovervågning, hvor igangværende udvikling af målrettede metoder nødvendigvis halter opdagelsen af nye kemiske forbindelser. Der er behov for, derfor har fremadrettede metoder, der kan opdage nye og uventede forbindelser, overvåge disse arter over tid og løse detaljer af deres kemiske struktur til at aktivere fremtidige arbejde i menneskers sundhed. Med henblik herpå, ikke-målrettet analyse af høj opløsning massespektrometri tilbyder en bred base påvisning tilgang, der kan kombineres med næsten alle stikprøveprogram forberedelse og giver betydelige muligheder for sammensatte identifikation efter detektering. Heri, vi beskriver en solid-fase ekstraktion (SPE) baseret prøve koncentration metode tunet til kortere kæde og mere hydrofile PFAS kemi, som per fluorholdige ether syrer og sulfonater, og beskrive analyse af prøver forberedt på denne måde i både målrettede og ikke-øremærket tilstande. Målrettede metoder til at give overlegen kvantificering når referencestandarder findes men er uløseligt begrænset til forventede forbindelser, når du udfører analyse. I modsætning hertil er kan en ikke-målrettet tilgang identificere tilstedeværelsen af uventede forbindelser og give nogle oplysninger om deres kemiske struktur. Oplysninger om kemiske funktioner kan bruges til at korrelere forbindelser på tværs af prøven steder og spore overflod og forekomsten over tid.
Klasse af pr- og polyfluoroalkyl stoffer (PFASs) er persistente organiske miljøgifte med væsentligt folkesundhedsproblem. Særlige forbindelser perfluorooctanoic acid (PFOA) og perfluorooctanesulfonate (PFOS) har drikkevand sundhed rådgivende niveauer af EPA1,2 og deres store amerikanske produktion ophørte i 2000s3,4 . For at opnå en betydelig forståelse for egenskaberne for PFAS er materialer i tekstil og forbruger produkt fremstilling kugler, hundredvis, hvis ikke tusinder, af alternative PFAS kemi blevet udviklet for at udfylde produkt nicher, herunder erstatninger for den forældede forbindelser5,6,7,8. Der er en igangværende skal overvåge de miljømæssige niveauer af straight kæde perfluorinated carboxylsyrer og perfluoroktansulfonater sådan PFOS, PFOA og deres homologe serier, men nye kemiske forbindelser er ikke omfattet af etablerede metoder såsom EPA Metode 5379 og ofte manglende analysestandarder for traditionelle målrettet analyse. Hensigten med denne protokol er således to gange. Det giver en sti til den målrettede LC-MS/MS analyse af fluorochemical arter i vand hvor analysestandarder er tilgængelige og detaljer problemfri integration af en ikke-øremærket, høj opløsning massespektrometri-baseret tilgang til analyse af data der giver mulighed for påvisning af ukendt eller uventet forbindelser i de samme prøver.
Fast-fase ekstraktion (SPE) er en etableret teknik til at prøve oprydning og koncentration med programmer til mange analysander og prøve matricer10,11. For PFAS analyse, flere solid retentive faser herunder ikke-polære, functionalized polar og ionbytning kolonner har været anvendt i varierende omfang til underklasser af fluorholdige arter i en bred vifte af matricer9,12, 13,14,15,16. Fremskridt i SPE prøve analyse ved hjælp af on-line opsætninger høj grad øge gennemløbet af tilgangen og forbedre reproducerbarhed af prøven håndtering, men den grundlæggende proces forbliver konsistent17. Nogle indsats for at fjerne offline koncentrationen af SPE-selskabet ved hjælp af store volumen injektioner er også blevet gennemført, men disse kræver ændringer til kromatografien, der placerer dem uden for realm af casual analyse18,19 . Vores prøve analyse bruger et polymert svage anion exchange (voks) retentive fase at grundigt adskille sure PFAS materialer fra de traditionelle organiske forurenende stoffer samtidig opnå betydelige prøve koncentration faktorer. Denne voks fase er vigtig at fange de kortkædede perfluorinated syrer som perfluorobutane sulfonat (PFBS) eller perfluorinated ethere såsom hexafluoropropylene oxid dimer syre (HFPO-DA), som er mere polære end den længere kæde arv perfluorinated art20,21. Da der har været et betydeligt skift i retning af kortere fluorholdige kæder og ether integration i de seneste PFAS kemi5, kan denne fase mere grundig genoprettelse af roman forbindelser til MS analyse.
Målrettet LC-MS/MS kvantitering bruger godkendte standarder og stabil isotop mærket interne standarder giver en uovertruffen grad af specificitet og sensitivitet til kvantitativ analyse. Denne tilgang er ønskeligt i mange situationer, men det er upraktisk for alt for almindelige situationer i analyse. Målrettede strategier virker kun til arter, der er forventet i prøven, og hvilke metoder har tidligere været etableret. For nye og kommende forbindelser med denne tilgang er i stand til selv opdage arter, som kan være af interesse, uanset deres kemi eller koncentration, og lav opløsning massespektrometre er næsten i stand til at levere tilstrækkelige oplysninger til at gøre utvetydig kemiske tildelinger af ukendt forbindelser. Derfor opstået inden for ikke-målrettet analyse, udnytte kraften i høj opløsning moderne massespektrometre at analysere prøver uden en forudsatte hypotese og med tilbagevirkende kraft tildele kemikalier til påviselige funktioner i prøven. Denne tilgang har været udbredt inden for biologi22,23,24 og miljøvidenskab25,26,27 på mange klasser af kemikalier. Perfluorerede kemikalier er særligt ligetil at identificere i denne metode på grund af deres unikke masse spektrale mønstre, og hundredvis af forbindelser er blevet beskrevet i blot de sidste par år5,28.
Protokollen drøftet her er beregnet til at justere målrettede LC-MS/MS PFAS kvantitering med behovet for at identificere og semi-kvantitativt overvåge nye forbindelser af interesse. SPE fase udvælgelse og prøve forberedelse teknikker er beregnet til at sikre erobringen af mere hydrofile nye PFAS syrer fra vand og kan være mindre egnet til længere kæde polymere arter og ikke-ionisk. Yderligere, de data, der genereres af ikke-målrettet analyse er tætte og af høj dimensionalitet, som nødvendiggør brug af data analyse software. Disse softwarepakker er ofte leverandør specifikke og kræver ændring at operere mellem instrument platforme. Om muligt, analyse proces er blevet beskrevet i en generisk mode og open source/freeware alternativer der refereres til, men effektiviteten og nøjagtigheden af nogen software tilgang skal vurderes på et individuelt grundlag.
Prøven håndtering og forberedelse
Optagelse af reference/spike standarder er af afgørende betydning for enhver målrettet analyse, da de giver en bagstopper for at kontrollere analytiske validitet. Manglende QC prøver forhindrer enhver vurdering af nøjagtigheden af resultaterne; den allestedsnærværende karakter af fluorochemicals betyder, at chancen for forurening af feltprøver, behandling af materialer eller LC-MS system er ikke ualmindeligt og skal regnskabsføres. Yderligere, det giver mulighed for validering af protokollen uanset variation i den daglige prøve behandling, som mange af skridt kan være meget varierende, især SPE-selskabet og prøve koncentration trin. Udvinding af både ældre og nye perfluorinated kemikalier kan være stærkt påvirket af valget af stationær fase for koncentration, og komponenter af kilde prøver, som pH og saltholdighed46. Indflydelse af prøven betingelser bør overvejes, hvis bestemte kategorier af pefluorinated kemikalier er af interesse. Alternative stikprøveprogrammer forberedelse for vand ekstrakter kan anvendes, hvis opsætningen laboratorium er tilgængelige og downstream dataanalyse forbliver lignende.
Målrettet dataanalyse
Forbindelser med tilgængelige standarder og matchede, stabile isotop mærket interne standarder, er de primære bekymring for dataanalyse instrumental og bestemmelse af metode detektionsgrænser og egnet rapportering intervaller kan bestemmes på en laboratorium ved laboratoriet grundlag ved hjælp af standard metoder, såsom signal-støj-forholdet fra laveste-niveau-standard spikes47. I mangel af matchede interne standarder kan opstå fejl fra forkerte matrixeffekter og præcis back-forudsigelse af spidse prøver kan anvendes til at vurdere nøjagtigheden af målingerne. Når mangler standarder for at forberede en kurve, et kvantitativt skøn med en ukendt kan gøres ved at behandle det ens til en nøje afstemt standard sammensatte, men fejl i estimatet er på rækkefølgen af 10 + fold med begrænset evne til at kvantificere usikkerheden, se McCord, Newton og Strynar21. I disse tilfælde tendens data kan stadig være indsamlet, men koncentrationen skøn er i sagens natur upålidelige.
Ikke-øremærket dataanalyse
Peak picking indstillinger har en betydelig indvirkning på antallet af kemiske funktioner identificeret, men kvaliteten af funktion udvælgelse er også stærkt påvirket. Beslutninger af interesse i peak plukning er 1) intensiteten af individuelle masserne skal medtages i spectra, ion overflod tærskel 2) intensiteten af uddraget Kromatogrammets toppe betragtes funktioner, funktion overflod tærskel 3) funktion opdagelse frekvens, Repliker tærsklen og 4) analytisk variation, CV tærskel (figur 10).
Indstilling urealistisk lave tærskler for peak picking resultater i en eksponentiel stigning i prøven tid at løse yderligere funktioner i stadig lav overflod (tabel 7). Ion-overflod tærskel filtre masse spektrale beskrivere hvor nok af de enkelte isotop mængder ikke kan passere grænsen. Dette vælger ideelt kun for funktioner med kvalitet MS spektre, sikre de rigtige kemiske funktioner i stedet for instrumental støj, og giver mulighed for formel forudsigelse i downstream behandling. En passende tærskel er baseret på instrumentale støj, helst mindst 3 x støj tærsklen for MS1 scanner. Funktionen overflod tærskel filtre kemiske egenskaber baseret på intensitet eller område af funktionen kromatografiske udvundet. Dette trin giver mulighed for afvisning af lav overflod toppe, der er typisk af dårlig kromatografiske kvalitet, har høje afvigelser eller resultatet af andre fattige software udvinding. En passende tærskel skal fastlægges pr. eksperiment, og matrix baseret på et acceptabelt niveau af dårlig funktion generation (fx funktioner under tærsklen udviser uacceptabelt dårlige kromatografi). Analytiske QC kan yderligere bruges til at afvise funktioner på kromatografisk baseret på inkonsekvent identifikation i analytisk og/eller forberedende flergangsbestemmelser (Repliker tærskel) eller baseret på dårlig reproducerbarhed på tværs af flergangsbestemmelser (CV tærskel). Relevante niveauer afhænger af kvaliteten af peak integration software bruges og de kemiske enheder under undersøgelsen. Vandopløselige perfluorerede forbindelser og let optimeret integration protokoller, funktioner bør identificeres i 80 + % af analytiske replikater og CVs forventes at falde til under 30%, som beskrevet i afsnittet metoder.
Toppene opdaget fra ikke-målrettet analyse give ikke kvantitative skøn over koncentrationer af materialer registreres. Yderligere, sande ubekendte identitet kan være svært at bekræfte fordi Roman forbindelser er fraværende fra offentligt tilgængelige databaser. Roman Strukturbestemmelse kræver omfattende analyse med flere metoder og kræver ekspertise i både massespektrometri og kemi. Normalisere toparealer kemiske funktioner kan dog yde semi-kvantitative skøn over koncentrationer af ubekendte fra kendte arter21. Hvis konsekvent prøveudtagning og forberedelsestrin er ansat, kan trend tidsoplysninger for individuelle arter oprettes for at overvåge persistens af et kemisk stof ind i fremtiden som svar til en individuel art skal være konsekvent spærring store variationer i matrix21.
Den primære fordel ved denne metode er udvidelsesmuligheder prøve behandling tillade både målrettet og disse analyse. Mens målrettet analyse giver tilsvarende eller superior kvantitative oplysninger, mangler det meget bredde af analyse ønsket når der beskæftiger sig med nye materialer, samt deres forhold til matrix materialer. Anvende en målrettet metode, eller endda en mistænkt screening metode baseret udelukkende på kendte materialer og begrænset databaser er helt blind for tidligere ubemærket arter, selvom de kan have betydelige sundhedsmæssige virkninger. Som software forbedrer og databaser bliver mere robust, fortsat nøjagtigheden af ukendt identifikation vil stige med en ledsagende fald i den tid investeringer og ekspertise nødvendigt at analysere det flerdimensionelle data genereret af dette tilgang. Data, der genereres i øjeblikket er dog af betydelig fremtidig værdi fordi data bank giver mulighed for post-hoc analyse med nyudviklede software og giver mulighed for sammenligning på tværs af tid selvom identiteten af en registreret stof er i øjeblikket ukendt.
The authors have nothing to disclose.
US Environmental Protection Agency, gennem dens kontor for forskning og udvikling, finansieret og forvaltet den forskning, der er beskrevet her. Dette dokument har gennemgået af US Environmental Protection Agency, Office for forskning og udvikling, og godkendt til offentliggørelse. Synspunkterne i denne artikel, er dem af forfatterne og nødvendigvis repræsenterer ikke synspunkter eller politikker af US Environmental Protection Agency. Denne forskning blev delvist understøttet af en udnævnelse til Postdoctoral forskningsprogrammet på den nationale eksponering Research Laboratory administreres af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse gennem tværinstitutionelle aftale DW89992431601 mellem de US Department of Energy og US Environmental Protection Agency.
Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Balance | Mettler | AB204S | |
BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
Standard Solutions | |||
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
Software | |||
Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
Profinder | Agilent | Or open source software packages |