astyanax भ्रूण के लिए स्वस्थानी संकरण में wholemount
Summary
इस प्रोटोकॉल भ्रूण astyanax cavefish में जीन अभिव्यक्ति के दृश्य को सक्षम बनाता है । इस दृष्टिकोण को अधिकतम जीन अभिव्यक्ति संकेत के लक्ष्य के साथ विकसित किया गया है, जबकि गैर विशेष पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने ।
Abstract
हाल के वर्षों में, अंधा मैक्सिकन cavefish के लिए एक मसौदा जीनोम (astyanax mexicanus) जारी किया गया है, जीन के हजारों के लिए अनुक्रम पहचान खुलासा । इस उभरते मॉडल प्रणाली में पहले अनुसंधान व्यापक जीनोम व्यापक जांच है कि कई मात्रात्मक लक्षण loci (qtl) विभिंन गुफा से जुड़े phenotypes से संबंधित की पहचान की है पर कैपिटल में । हालांकि, लक्षणप्ररूपी परिवर्तन के लिए ह्य आधार के लिए ब्याज के जीन कनेक्ट करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. एक तकनीक है कि troglomorphic विकास में विकास की भूमिका की गहरी समझ की सुविधा कर सकते है पूरे स्वस्थानी संकरण में माउंट है । इस तकनीक को सीधे गुफा के बीच जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है और सतह पर रहने वाले रूपों, उंमीदवार नामित स्थापित qtl जीन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अध्ययन से ब्याज के जीन की पहचान, या अंय विकसित डिस्कवरी-आधारित दृष्टिकोण । इस रिपोर्ट में, हम एक सरल प्रोटोकॉल वर्तमान, एक लचीला चेकलिस्ट द्वारा समर्थित है, कि व्यापक रूप से अच्छी तरह से प्रस्तुत अध्ययन प्रणाली से परे उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह आशा व्यक्त की है कि इस प्रोटोकॉल astyanax समुदाय और परे के लिए एक व्यापक संसाधन के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
Introduction
स्वस्थानी संकरण में निर्धारित ऊतकों को धुंधला करने के लिए एक सामान्य विधि है जो जीन अभिव्यक्ति पैटर्न1को देखने के लिए होती है । इस तकनीक को अंय पारंपरिक2 और गैर पारंपरिक3 मॉडल प्रणालियों में वर्षों के लिए प्रदर्शन किया गया है, जैविक अध्ययन की एक किस्म के लिए । हालांकि, इस कार्यविधि को सफलतापूर्वक करने के लिए कई चरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है । जांचकर्ताओं जो इस तकनीक का प्रदर्शन नहीं किया है के लिए, प्रक्रिया की शुरुआत कई शामिल कदम के कारण डरा दिया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रक्रिया की लंबी प्रकृति ही तकनीकी त्रुटियों के लिए उधार देता है, जो समस्या निवारण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
इस लेख के समग्र लक्ष्य के लिए एक सरल और सीधा तरीका है कि इस संकरण एक व्यापक दर्शकों के लिए सुलभ तकनीक प्रदान करेगा पेश है । त्रुटियों की शुरूआत को कम करने के लिए, हम एक सीधा दृष्टिकोण है कि पैदावार उच्च गुणवत्ता जीन अभिव्यक्ति धुंधला और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत कम कर देते हैं । यह प्रक्रिया पारंपरिक मॉडल प्रणालियों में विकसित अन्य दृष्टिकोणों के समान है, जैसे कि डेनियो रेरियो4. यहाँ, हम एक डाउनलोड चेकलिस्ट (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग कर प्रत्येक कदम के सावधान कार्यान्वयन की सुविधा के लिए, प्रोटोकॉल के सावधान कार्यान्वयन को बढ़ावा देने के उद्देश्य. ऐसा करने के लिए तर्क इस प्रक्रिया में शामिल कई चरणों के माध्यम से संगठन की सुविधा के लिए है । यह लेख पूरे प्रदर्शन में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है-भ्रूण विकासशील में स्वस्थानी संकरण में माउंट, लेकिन अभी तक प्रक्रिया नहीं किया है । astyanax शोधकर्ताओं के लिए चुना दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह परीक्षण किया गया है और दोनों cavefish और सतह मछली morphs में सिद्ध है, जिससे तुलनात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण की सुविधा । प्रस्तुत विधि astyanax और अंय प्रणालियों पर अध्ययन में शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए के क्षरण के लिए जोखिम के कारण, प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक आरएनए जांच के बाँझ संश्लेषण से संबंधित है । हालांकि, अगर एक जांच ध्यान से उत्पंन है, और अच्छे परिणाम प्रदान करता है, यह ब?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए सकल प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम चार हाई स्कूल के छात्रों को स्वीकार करना चाहते हैं, जो २०१७ और २०१८ में गर्मियों में इंटर्नशिप के दौरान इस प्रोटोकॉल का उपयोग क्रिस्टीन काओ, माइकल वार्डन, आकि ली, और डेविड nwankwo सहित । hl २०१७ की गर्मियों के दौरान एक यूसी जीव विज्ञान स्टेम फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम के अनुदान द्वारा समर्थित था राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब-१४५७६३० करने के लिए jbg), और दंत चिकित्सा और craniofacial अनुसंधान के राष्ट्रीय संस्थानों (nih; DE025033 to jbg).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
Referenzen
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