Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

1. 솔루션 준비 주의: 3이 프로토콜 (톨루엔, dimethyldichlorosilane, 및 dithiothreitol)에 사용 된 시 약은 매우 유독 하다. 사용 하기 전에 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 또한,이 프로토콜의 부분 같이 안전 안경, 보호 장갑의 두 세트를 착용 하는 보호의 높은 수준에서 수행 해야 합니다. 그렇지 않으면 권고 하지 않는 한 실험 모든 적절 한 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전장 바지 및 폐쇄 발가락 신발)를 사용 하는 동안 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다. 참고: ATP, kinesin,이 프로토콜에 사용 되는 microtubules의 농도 수정할 수 있습니다 각 실험의 요구를 주어진. 그러나, 수정, 확인 하십시오 다른 시 약의 최종 농도 주어진 동일 하 게 유지는 아래. 모든 실험은 실 온 (25 ° C)에서 수행 했다. 재고 솔루션의 준비참고: 준비 및 aliquot 미리 다음 솔루션. 모든 aliquots는 실 온 (25 ° C)에서 준비 될 수 있습니다. BRB80 버퍼참고:이 프로토콜에 사용 되는 솔루션의 대부분을 위한 버퍼는 BRB80. BRB80 대량으로 준비 하 고는-20 ° C 냉동 고에 저장 된 수 있습니다. 24.2 g 분해 piperazine-N, n ′-bis(2-ethanesulfonic acid) (파이프) 및 이온된 물 800 mL에 수산화 칼륨 (KOH)의 3.1 g 100 m m 파이프의 800 mL를 만들려고. 수산화 칼륨 (KOH)와 8에 pH 파이프 및 EGTA의 해산에 수 1 L. 올리기의 최종 볼륨을 100 mL 10 m m 염화 마그네슘 (MgCl2)의 10 mM 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA) 100 mL를 추가 합니다.참고: BRB80 버퍼에 화학 물질의 최종 농도 80 m m 파이프, 1 mM MgCl2, 및 1 밀리미터 EGTA. 6.9 코 및 염 산 (HCl)를 사용 하 여 버퍼의 pH를 조정 합니다. ATP 100 mM 초순에 ATP의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -80 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. GTP 25mm 초순에 GTP의 500 μ 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 5 μ aliquots로. -80 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. MgCl2 100 mM MgCl 초순에2 의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. 카 세 인 그리고 건조 카 제인의 1 g 무게 50 mL 원뿔 원심 관에 그것을 전송. 카 세 인 분말을 튜브에 BRB80 버퍼의 35 mL를 추가 합니다. 밤새 해산 추운 방에 텀블러에 솔루션을 배치 합니다. 이 시점에서 솔루션 두껍고 점성을 찾을 것입니다. 튜브 수직 어떤 큰 소화 덩어리 정착 수 있도록 4 ℃ 냉장고에 둡니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송. 더 많은 침전 물 밖으로 펠 렛을 1000 x g 에서 원심 분리기에 튜브를 회전 합니다. 다시 한번, 새로운 튜브는 상쾌한 전송. 반복적으로 0.2 μ m (최대 압력 바 7) 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 두께가 되 고 솔루션, 많은 필터 막힌 얻을 것 이다, 그래서 필터는 분명 때까지이 단계를 반복 하 고 unclogged. UV/Vis 분 광 광도 법, 280 nm20에서 19 m m-1∙cm-1 의 카 제인의 소멸 계수를 사용 하 여를 사용 하 여 결과 솔루션에서 카 세 인 농도 결정 합니다. 카 세 인에 대 한 23 kDa의 분자량을 가정할 경우, 솔루션에 BRB80 20 mg∙mL-1 의 농도를 희석. 피펫으로 20 μ aliquots로-20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 하 고. D-포도 당 초순에 2 M D-포도의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. 포도 당 산화 효소 20 mg∙mL-1 포도 당 산화 효소 BRB80에서의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. 카 탈 라 제 BRB80에서 0.8 mg∙mL-1 catalase의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. Dithiothreitol (DTT)참고: DTT 약간 휘발성과 독성 때문에, 연기 후드 다음 단계 수행 하시기 바랍니다. 1 M 초순에 희석 DTT의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. Paclitaxel 1mm paclitaxel DMSO에 희석의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)참고: 이러한 실험에 사용 된 DMSO는 순수. 피펫으로 10 μ aliquots에 순수한 DMSO의 1 mL. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. Creatine 인산 염 초순에 0.2 M creatine 인산 염의 1 mL 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. Creatine phosphokinase 200 units·의 1 mL 해결책 준비 초순에 L-1 creatine phosphokinase. 피펫으로 10 μ aliquots로. -20 ° C 냉동 고에는 aliquots를 저장 합니다. 니켈 (II) 황산 염 초순에 50 m m 니켈 (II) 황산 염의 해결책의 500 mL를 준비 합니다. 실 온 (25 ° C)에서 솔루션을 저장 합니다. Poly(ethylene glycol)-블록-poly(propylene glycol)-블록-poly(ethylene glycol) (말뚝-점-PEG) 솔루션 못-점-말뚝의 2 밀리 그램을 무게 (수 평균 분자량: 14,600 g∙mol-1)-종이 무게에 NTA 분말. 못-점-말뚝-NTA 기능성된 nitrilotriacetic 산 (NTA) 그룹 triblock 공중 합체 이다. 못-점-말뚝-주권에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 분말을 전송 합니다. 튜브를 재고 니켈 (II) 황산 염 해결책의 1 mL를 추가 합니다. 분말 해산 때까지 소용돌이 볼 수 없는 수 풀 남아 있다. 실 온에서 1 달까지에 대 한 저장소입니다. 실험을 시작 하기 전에 얼음 양동이 채울. 각 섹션 위의 1.1.13를 1.1.1에서에서 설명 하는 13 시 약의 한 약 수 고 양동이, 따라서 얼음에 그들을 유지에 그들을 추가. 사용 하기 전에 시 약의 각 동. Microtubule 준비참고: Microtubules의 동결 건조 된 tubulin 염료 라는 20 μ g 약 수에서 생산 했다. 647의 염료의 여기 파장은 nm. Microtubule 성장 버퍼의 준비 피펫으로 21.8 작은 (0.6 mL) microcentrifuge로 BRB80 버퍼의 μ 튜브. MgCl2 재고 솔루션의 1 μ, GTP 재고 솔루션의 1 μ 그리고 DMSO 재고 솔루션의 1.2 μ를 추가 합니다.참고: 따라서, BRB80 버퍼에 시 약의 최종 농도 4 mM MgCl2, 1 mM GTP, 및 5% (v/v) 디 메 틸 sulfoxide. Microtubule 합 레이블이 지정 된 동결 건조 된 tubulin의 약 20 μ g 수에 직접 microtubule 성장 버퍼의 6.25 μ를 추가 합니다. 와 5 대 약 수 동 30 rps에서 s. 45 분 동안 37 ° C에서 배양 전에 5 분 동안 얼음에 약 수를 냉각 하 고 1.3.3 섹션을 진행 합니다. Microtubule 안정화 BRB80 버퍼의 490 μ를 aliquoted paclitaxel 솔루션의 5 μ를 추가 합니다. 소용돌이 10 솔루션 30 rps에서 s. 일단는 microtubules에 대 한 보육의 45 분을, BRB80/paclitaxel 솔루션 생산 microtubule 솔루션의 5 μ를 추가 합니다.참고:이 100 희석, 안정, microtubule 솔루션 것이 라고 하 MT100. 그것은 최대 5 일 동안 사용 될 수 있습니다 그리고 각 실험에 대 한 원하는 microtubule 밀도를 희석 수 있습니다. 운동 성 솔루션 효소 antifade, ATP 시스템, 재생 및 ATP BRB80 버퍼의 291 μ를 aliquoted 카 세 인 솔루션의 9.0 μ를 추가 합니다. 경우 원하는 ATP 농도 실험에 대 한 새로운 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 BRB80/카 제인 솔루션의 피펫으로 83 μ m m 1 보다 낮습니다. 그렇지 않으면, 피펫으로 85 μ 새로운 0.6 mL microcentrifuge 관으로 그 솔루션의. 그 튜브를 D-포도 당, 포도 당 산화 효소의 1 μ, 카 탈 라 제의 1 μ의 DTT의 1 μ 1 μ를 추가 합니다.참고: 이러한 화학 물질 구성 된 효소를 제거 하 여 photobleaching를 감소 시킬 것 이다 antifade 칵테일21 녹은 산소와 냉각 반응 기. 이 photobleaching 및 microtubule 해체 형광 이미징22,23동안 여기 조명에 의해 발생을 줄일 수 있습니다. ATP 농도 1 m m 보다 크게 낮은 것을 선택 하는 실험에 대 한 다음과 같은 시 약을 솔루션에 추가 ATP 회생 시스템을 만들: aliquoted creatine 인산 염 솔루션 및 aliquoted creatine의 1 μ 1 μ phosphokinase 솔루션입니다. 운동 성 솔루션 주식 ATP 솔루션의 1 μ를 추가 합니다. 영화 또는 소용돌이 homogenously 화학 제품을 배포 하는 약 수.참고: 따라서, 솔루션에 화학 물질의 최종 농도 10 μ M paclitaxel 0.5 mg·mL− 1 카 세 인, 20 m m D-포도 당, 200 μg·mL− 1 포도 당 산화 효소, 8 μg·mL− 1 catalase, 10 m m dithiothreitol, 2 mM creatine 인산 염 (추가) 하는 경우, 2 units· L− 1 creatine phosphokinase (추가) 하는 경우, 그리고 1 mM ATP. 이 운동 성 솔루션으로이 솔루션을 지칭 합니다. Kinesin참고:이 실험에 사용 된 재고 kinesin 솔루션 통합 나노 Sandia 국립 연구소에 대 한 센터에서 G. Bachand에 의해 준비 되 고 사용자 계약 (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php)에서 사용 가능. 여기에 사용 되는 버퍼 구성 되어 이미 40 mM, 300 mM NaCl, 0.76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 자당, 0.2 m m TCEP, 및 50 μ M Mg-ATP. 이 일련의 실험에 대 한 rkin430eGFP kinesin 구문 사용 되었다. Kinesin 쥐 kinesin 무거운 체인 eGFP 고 C 터미널 그 태그를 꼬리 도메인24에서 융합의 처음 430 아미노산의 구성입니다. 그것은 대장균에 표현 했다 고 정화 Ni−NTA 열을 사용 하 여. GFP kinesin 재고 용액의 농도 UV/Vis 분 광 광도 법, GFP 489 nm25, 55 m m-1·cm-1 의 대 한 소멸 계수를 사용 하 여 정한 1.8 ± 0.3 μ M 이며 그 kinesin 고려는 이합체. 실험에 대 한 원하는 kinesin 농도 또는 표면 밀도 결정 합니다. 일반적인 분석 실험,이 농도 20 nM. Kinesin 농도 희석 하는 경우 보다 더 hundred-fold, 0.5 mg·mL-1 카 제인의를 포함 하는 BRB80의 솔루션에 희석. Approximatively 20의 최종 농도 얻기 위해 운동 성 솔루션 kinesin 솔루션의 1 µ L를 추가 nM. Microtubules 10 μ MT100 솔루션 섹션 1.3 운동 성 솔루션에 추가 합니다.참고:이 운동 성 솔루션은 최대 3 시간 동안 사용할 수 있습니다. 그 시간 후에 antifade 시스템 솔루션에 포도 당 효소 반응에 의해 고갈 때문에 그 효과 잃는다. 2. 흐름 셀 조립 coverslips 세척 흐름 세포에 대 한 큰 coverslip 사용 (차원: 60 m m x 25 m m)와 작은 하나 (크기: 22 x 22 mm)19. 모든 coverslips 초순 두 번 에탄올과 두 번 씻어. 5 분 50-75 ° c.의 온도에 오븐에서 그들을 건조 초순에 coverslips를 sonicate 청소기 자외선/오존을 사용 하 여 ( 테이블의 재료 와 제조 업체의 지침을 참조), 실 온 (25 ° C)에서 및 일반 대기 상태에서 15 분 수행이이 단계 수에 대 한 각 coverslip의 한쪽을 치료 (압력 1의 atm). 조심 스럽게 (핀셋을 사용 하 여) 그것의 다른 측에 각 coverslip 바뀌고 자외선/오존 치료 뿐만 아니라 그 쪽. 50-75 ° c.의 온도에 오븐에서 그들을 다시 건조 하기 전에 5 분 동안 다시 초순에 coverslips를 sonicate 못-점-말뚝 코팅 수 있도록 coverslips 치료참고:는 dimethyldichlorosilane와 매우 독성이 되 고 프로토콜의이 부분에 사용 되는 톨루엔 다음과 같은 예방 조치를 복용 하는 동안 증기 두건에서 다음 단계를 수행: 보호 장갑 및 긴 소매 셔츠 그들의 실험실에서의 두 세트를 착용 코트입니다. 팔 뚝에서 피부가 한 흘림의 경우 화학 물질에 직접 노출 되는 셔츠의 소매 안에 장갑의 가장자리를 감싸 다. 보호 안경 착용. 475 ml 톨루엔의 순수한 dimethyldichlorosilane의 25 mL를 희석. 15 초 동안 각 coverslip dimethyldichlorosilane 및 톨루엔 용액에 담가. 톨루엔에 두 번, 세 번 메탄올에는 coverslips를 씻어. 고압된 질소를 사용 하 여 coverslips를 건조. 흐름 세포로 coverslips를 조립 일단은 coverslips 건조, 세로로 두 1 cm x 2.5 cm 줄무늬에 양면 테이프 2 c m x 2.5 c m 조각 잘라. 섬세 한 작업와이 퍼에 큰 coverslip 넣고 테이프의 조각 사이 1 c m x 2.5 c m 영역을 만들려면 coverslip의 가장자리를 따라 세로로 테이프 줄무늬를 스틱. 흐름 셀 조립 마무리 테이프 줄무늬 위에 작은 coverslip 스틱. 3. 흐름 셀 솔루션 흐르는 조립된 흐름 셀으로 approximatively 20 μ 말뚝 점 못 솔루션의 흐름. 셀에 비행 볼륨 챔버를 채울 수 있다. 다음 단계에서는 솔루션을 교환할 때 동일한 볼륨을 사용 합니다. 5 분 동안 표면에 흡수 못 PPG 못 솔루션에 대 한 허용. 버퍼를 흐르는 BRB80 버퍼 말뚝 점 못 솔루션 3 번을 교환 합니다. 흐름 세포에 운동 성을 솔루션 흐름. 계획 된 실험 한 시간 보다 긴 경우 증발을 방지 하기 위해 그리스와 흐름 셀의 가장자리를 밀봉 하십시오.참고: 흐름 셀은 이제 몇 군데 될 준비가. 4. 이미징 플로우 셀 이미지는 microtubules와 kinesin 모터 ( 재료의 표참조)에 대 한 목표 형 총 내부 반사 형광 (TIRF) 설치를 사용 하 여 수행 합니다.참고: 여기, 우리가 사용한 현미경 100 배 1.49 / 숫자 조리개 렌즈, 642의 파장을 가진 한 두 개의 레이저를 사용 하 여 및 140의 최대 전력 mW, 그리고 또 다른 파장 488 nm 및 150의 최대 전력 mW. 목표에 집중 오일 한 방울을 놓습니다. 현미경 플랫폼에 흐름 셀을 배치 하 고 목적에 기름과 흐름 세포 사이 접촉까지 목표를가지고. 현미경의 연동 커버 시스템을 사용 하 여 탈출에서 모든 레이저 빛을 차단. 레이저를 켜고 흐름 셀의 낮은 표면에 집중. microtubules 붙일 표시 및 647의 파장에 흥분 nm. 그들은 488 nm 레이저 GFP kinesin 모터 사용 된다 642 nm 레이저를 사용 하 여 몇 군데 있을 것입니다. 이미지 또는 동영상의 기록 합니다. 일반적으로, 레이저 전원이 약 30 mW 및 둘 다에 대 한 50 ms의 노출 시간 레이저 채널. 만큼 거기 운동 흐름 셀에 대 한 이미지를 기록할 수 있습니다.참고: 레이저 조명 발가 벗은 눈에 대 한 유해 하 고 회복 불능의 피해를 일으킬 수 있습니다. 조명된 영역을 불투명 뚜껑을 완전히 덮여 있는지 확인 하십시오.