Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Radiofarmaci chimici lungo hanno sfruttato la selettività e specificità degli anticorpi per biomarcatori della malattia per entrambi imaging nucleare e mirata radioterapia¹. Gran lunga il più comune approccio per la radiomarcatura di anticorpi si basa sull’attacco indiscriminato di radiomarcato gruppi prostetici o radiometal chelatori agli aminoacidi — più spesso lisine — all’interno della struttura dell’immunoglobulina ( Figura 1A)². Mentre questa strategia è certamente efficace, la sua natura casuale, non sito specifico può creare problemi. In particolare, gli approcci tradizionali bioconjugation producono mal definito ed efattori eterogenei costituiti da miscele di migliaia di regioisomeri differenti, ognuna con un proprio set di proprietà biologiche e farmacologiche³. Inoltre, bioconjugation casuale può ostacolare il immunoreactivity di anticorpi, se il carico viene aggiunto ai domini di antigene-legante di immunoglobulina.

Nel corso degli anni, una varietà di strategie bioconjugation site-specific e sito-selettivi sono stati sviluppati al fine di affrontare questi problemi^4,5. Il più comune di questi approcci si basa sulla legatura delle sonde maleimide-cuscinetto ai gruppi solfidrilici di cisteine (Figura 1B). Gli anticorpi IgG1 contengono naturalmente 4 ponti disolfuro di inter-catena, legami che possono essere ridotti in modo selettivo per produrre i tioli gratuiti in grado di subire reazioni di addizione di Michael con le maleimidi per formare legami tioetere succinimidyl. L’uso dei tioli e le maleimidi è certamente un miglioramento rispetto ai metodi tradizionali e un’ampia varietà di maleimide-cuscinetto Sintoni e chelanti bifunzionali attualmente disponibili. Tuttavia, è importante notare che questa metodologia ha seri limiti pure. Basato su maleimide efattori presentano limitata stabilità in vivo, poiché il sollevatore thioether possa subire una reazione di retrò-Michael (Figura 2)^{6,7,8,9, 10}. questo, naturalmente, può portare al rilascio di payload radioattivo o relativo scambio con biomolecole di tiolo-cuscinetto in circolazione (ad es., glutatione o albumina). Entrambi questi processi possono aumentare le concentrazioni di attività in organi sani, nonché diminuire le concentrazioni di attività nei tessuti bersaglio, con conseguente ridotta formazione immagine contrasto e rapporti terapeutici più bassi. Sono stati sviluppati diversi reagenti alternativi tiolo-reattive nel tentativo di eludere questi problemi, tra cui tosylates, bromo – e iodo-acetili e vinile solfoni^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. Tuttavia, tutti questi approcci presentano limitazioni che hanno ostacolato la loro applicazione diffusa.

Circa cinque anni fa, il laboratorio di Carlos Barbas III allo Scripps Research Institute ha sperimentato l’uso dei solfoni metil phenyloxadiazolyl come reagenti per la formazione selettiva di legami altamente stabile con tioli (Figura 1 e figura 3) ^{18 , 19}. gli autori hanno impiegato una variante del solfone-cuscinetto di metile phenyloxadiazolyl di fluorescina per modificare parecchi anticorpi ingegnerizzati per contenere residui di cisteina libera, producendo infine efattori con più alta stabilità che analoga costrutti creati utilizzando sonde maleimide-basato. Vedendo questo lavoro promettente, siamo rimasti un po’ sorpresi che questa tecnologia era stata utilizzata solo a malapena in radiochimica e non era stato ancora utilizzata affatto nella sintesi di chelanti bifunzionali o radioimmunoconjugates^20,21 . Questa scarsità di applicazioni, tuttavia, ben presto cominciò ad avere più senso: parecchi tentativi di procurarsi il reagente da Sigma-Aldrich ha provocato la ricevuta di miscele complesse di prodotti di degradazione con < 15% del composto desiderato. Inoltre, sintetizzando il reagente segnalato noi stessi non era un'opzione realistica, come il percorso sintetico pubblicato è alquanto complesso e richiede attrezzature sofisticate chimica organica che la maggior parte radiochimica e imaging molecolare laboratori — compreso il nostro — semplicemente non possiedono.

In risposta a questi ostacoli, abbiamo deciso di creare un facilmente accessibile e altamente stabile reagente del solfone di metile phenyloxadiazolyl che può essere ottenuto tramite un percorso sintetico robusto e ragionevolmente facile. All’inizio di quest’anno, abbiamo segnalato la creazione di un modulare, stalla e facilmente raggiungibile phenyloxadiazolyl metil solfone reagente — soprannominato ‘Baccelli’ — come una piattaforma per bioconiugazione tiolo-base (Figura 1 e figura 3)²². La differenza fondamentale tra le cialde e il reagente segnalato da Barbas, et al è che il primo impiega un anello di anilina attaccato nella frazione di phenyloxadiazolyl metil solfone, mentre quest’ultimo dispone di un fenolo nella stessa posizione (Figura 4). Questo cambiamento facilita un percorso sintetico più semplice e accessibile come pure — se la nostra esperienza con il composto commercialmente disponibile è emblematico — un reagente finale più stabile. In questo lavoro, abbiamo sintetizzato anche un paio di chelanti bifunzionali baccelli-cuscinetto — cialde-DFO e cialde-CHX-A cm-DTPA — per facilitare la creazione di ⁸⁹Zr – e ¹⁷⁷radioimmunoconjugates Lu-etichettati, rispettivamente. Come vedremo, abbiamo dimostrato che bioconiugazione sito-selettivo basato su cialde riproducibile e robustamente creare radioimmunoconjugates omogeneo, ben definito, altamente immunoreactive e altamente stabile. Inoltre, esperimenti preclinici in modelli murini di cancro colorettale hanno dimostrato che questi sito-selettivamente etichettato radioimmunoconjugates espositivo superior in vivo delle prestazioni rispetto agli anticorpi radiomarcati sintetizzati tramite maleimide-basato coniugazioni.

L’obiettivo generale di questo lavoro è quello di facilitare la creazione di ben definito, omogeneo, altamente stabile e altamente immunoreactive efattori per applicazioni in vitro e in vivo. L’approccio sintetico è abbastanza semplice da essere eseguito in quasi tutti i laboratori e il reagente di baccelli del genitore può essere modificato con una pletora di diversi chelatori, fluorofori o carichi. In questo protocollo e il video di accompagnamento, descriveremo la sintesi semplice, quattro fasi di baccelli (Figura 5); la creazione di una variante di baccelli-cuscinetto di DOTA, un chelatore ampiamente usato per il coordinamento di ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹a, ¹⁷⁷Lu e ²²⁵Ac (Figura 6); e il bioconjugation di baccelli-DOTA di un anticorpo di modello, il IgG1 come destinazione HER2 trastuzumab (Figura 7).