Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Attività biologiche sono in ultima analisi, effettuate dalle proteine, più di cui interagire con gli altri per corrette funzioni biologiche. Utilizzando un approccio computazionale, l’importo totale delle interazioni proteina-proteina in essere umano è stimato essere ~ 650.000¹e rottura di queste interazioni spesso conduce a malattie². A causa del loro ruolo essenziale nel controllo dei processi cellulari e organismi, sono stati sviluppati numerosi metodi per lo studio delle interazioni proteina-proteina, quali lievito-due-ibrido, complementazione bimolecolare fluorescenza, Spalato-luciferasi ³analisi di complementazione e co-immunoprecipitazione. Mentre questi metodi sono bravi a scoprire e confermando le interazioni proteina-proteina, sono solitamente non quantitativi e così fornire informazioni limitate sull’affinità tra i partner di proteine interagenti. Quantitativi di pull-down può essere utilizzato per misurare l’affinità di legame (ad esempio, la costante di dissociazione K_d), ma non misura la cinetica dell’associazione, né può essere applicata quando il K_d è molto bassa a causa di un’inadeguata rapporto segnale-rumore⁴. Surface plasmon resonance (SPR) spettroscopia quantifica la cinetica di legame, ma richiede una superficie specifica e l’immobilizzazione di un reattivo sulla superficie, che potenzialmente può modificare la proprietà di associazione del reagente⁵. Inoltre, è difficile per SPR misurare veloce associazione e dissociazione tariffe⁵, e non è opportuno utilizzare SPR per caratterizzare l’evento di scambio delle unità secondarie della proteina in un complesso proteico. Qui, descriviamo un metodo che permette di misurare il tasso di proteine complesse montaggio e smontaggio in una scala di tempo di millisecondo. Questo metodo è essenziale per determinare il ruolo di Cullin –unesso –Nedd8 –dissociated della proteina 1 (Cand1) come il F-box protein cambio fattore^6,7.

Cand1 regola la dinamica della ligasi E3 di Skp1•Cul1•F-casella proteina (SCF), che appartengono alla grande famiglia della ligasi di ubiquitin Cullin-anello. SCFs sono costituiti il cullin Cul1, che lega la proteina di dominio anello Rbx1, e una proteina F-box intercambiabile, che recluta substrati e lega Cul1 attraverso la proteina dell’adattatore Skp1⁸. Come una E3 ligasi, SCF catalizza la coniugazione dell’ubiquitina al suo substrato ed è attivato quando il substrato è reclutato dalla proteina F-box, e quando Cul1 viene modificato dalla proteina ubiquitina-come Nedd8⁹. Cand1 associa Cul1 non modificato e legandosi, disturba sia l’associazione di proteine Skp1•F-box con Cul1 e la coniugazione di Nedd8 a Cul1^10,11,12,13. Di conseguenza, Cand1 è sembrato essere un inibitore di attività SCF in vitro, ma Cand1 carenza negli organismi ha causato i difetti che suggerisce un ruolo positivo di Cand1 nel regolare l’attività SCF in vivo^{14,15,16 , 17}. questo paradosso infine è stato spiegato da uno studio quantitativo che ha rivelato le interazioni dinamiche tra proteine Cul1, Cand1 e Skp1•F-box. Usando le fluorescenza risonanza energy transfer (FRET) analisi che rilevano la formazione dei complessi SCF e Cul1•Cand1, l’associazione e dissociazione rate costanti (k_su e k_off, rispettivamente) sono stati misurato singolarmente. Le misurazioni hanno rivelato che sia Cand1 e Skp1•F-box forma estremamente stretta complesso proteico con Cul1, ma la k_fuori di SCF è aumentata drammaticamente di Cand1 e la k_fuori del Cul1•Cand1 è aumentato drammaticamente da Skp1•F-casella proteina^6,7. Questi risultati forniscono il supporto iniziale e fondamentale per definire il ruolo di Cand1 come un fattore di scambio di proteina, che catalizza la formazione di nuovi complessi SCF attraverso il riciclo Cul1 dai vecchi complessi SCF.

Qui, presentiamo la procedura di sviluppare e utilizzare il tasto test per studiare la dinamica del complesso Cul1•Cand1⁷, e lo stesso principio può essere applicato per lo studio della dinamica delle varie biomolecole. FRET si verifica quando un donatore è eccitato con la lunghezza d’onda appropriata, e un accettore con spettro di eccitazione sovrapposizione lo spettro di emissione del donatore è presente all’interno di una distanza di 10-100 Å. Lo stato eccitato viene trasferito al ricettore, quindi diminuendo l’intensità di donatore e aumentando l’ intensità di accettore¹⁸. L’efficienza della FRET (E) dipende dalla funzione del raggio di Förster (R₀) e la distanza tra il donatore e accettore fluorofori (r) ed è definito da: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). Il raggio di Förster (R₀) dipende da alcuni fattori, tra cui l’orientamento angolare di dipolo, la sovrapposizione spettrale della coppia donatore-accettore e la soluzione usata¹⁹. Per applicare l’analisi FRET su un fluorimetro flusso interrotto, che rileva la variazione dell’emissione dei donatori in tempo reale e permette di eseguire misure di veloce k_su e k_fuori, è necessario stabilire FRET efficiente che Risultati in una significativa riduzione dell’emissione di donatore. Di conseguenza, progettazione efficiente FRET scegliendo la coppia appropriata di coloranti fluorescenti e siti su proteine bersaglio per fissare i coloranti è importante e sarà discusso in questo protocollo.