Summary

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Published: March 14, 2019
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Summary

Interactions protéines-protéines sont essentielles pour les systèmes biologiques, et des études de la cinétique de liaison donnent un aperçu de la dynamique et la fonction de complexes protéiques. Les auteurs décrivent une méthode qui quantifie les paramètres cinétiques d’une protéine complexe à l’aide de transfert d’énergie de fluorescence par résonance et la technique de flux stoppé.

Abstract

Les protéines sont les principaux opérateurs des systèmes biologiques, et généralement, ils interagissent avec d’autres macro – ou petites molécules pour remplir leurs fonctions biologiques. Ces interactions peuvent être très dynamiques, ce qui signifie que les sous-unités qui interagissent constamment associées et dissociées à certains taux. Tout en mesurant l’affinité de liaison à l’aide de techniques telles que quantitative déroulant révèle la force de l’interaction, étudier la cinétique de la liaison rapide permet de mieux comprendre comment l’interaction se produit et combien de temps chaque complexe peut exister. En outre, mesurer la cinétique d’une interaction en présence d’un facteur supplémentaire, comme un facteur d’échange de protéine ou d’une drogue, permet de révéler le mécanisme par lequel l’interaction est réglementée par l’autre facteur, fournissant des connaissances importantes pour la promotion de la recherche biologique et médicale. Nous décrivons ici un protocole de mesure de la cinétique de la liaison d’une protéine complexe qui a un taux élevé association intrinsèque et peut être dissocié rapidement par une autre protéine. La méthode utilise le transfert d’énergie de fluorescence resonance pour signaler la formation du complexe protéine in vitro, et il permet la surveillance de la liaison rapide et dissociation du complexe en temps réel sur un fluorimètre flux stoppé. À l’aide de ce test, les constantes de vitesse association et dissociation de la protéine complexe sont quantifiées.

Introduction

Activités biologiques sont effectuées en fin de compte par des protéines, plus de qui interagissent avec les autres pour des fonctions biologiques appropriées. En utilisant une approche computationnelle, le montant total des interactions protéine-protéine chez l’homme est estimé à ~ 650 0001et perturbation de ces interactions souvent conduit à des maladies2. En raison de leur rôle essentiel dans le contrôle des processus cellulaires et organismiques, plusieurs méthodes ont été développées pour l’étude des interactions protéine-protéine, comme deux-hybride de levure, complémentation de fluorescence bimoléculaire, split-luciférase complémentation et co-immunoprécipitation test3. Si ces méthodes sont bons à découvrir et confirmant les interactions protéine-protéine, ils sont généralement non quantitative et ainsi fournissent des informations limitées sur les affinités entre les partenaires de protéines qui interagissent. Pull-down quantitative peut être utilisé pour mesurer l’affinité de liaison (par exemple, la constante de dissociation Kd), mais elle ne mesure pas la cinétique de la liaison, ni peut il être appliqué lorsque le Kd est très faible en raison d’une insuffisante rapport signal-sur-bruit4. Plasmonique de surface (SPR) spectroscopie quantifie la cinétique de la liaison, mais il nécessite une surface spécifique et l’immobilisation d’un réactif à la surface, ce qui peut potentiellement modifier la propriété de liaison du réactif5. En outre, il est difficile pour la SPR mesurer rapidement association et dissociation taux5, et il n’est pas approprié d’utiliser la SPR pour caractériser l’événement de l’échange de sous-unités protéiques dans un complexe de protéines. Nous décrivons ici une méthode qui permet de mesurer le taux de protéine complexe montage et démontage à une échelle de temps de milliseconde. Cette méthode a été essentielle pour déterminer le rôle d’ullin –unssociated –Nedd8 –dissociated protéine C 1 (Cand1) que le F-box protéine échange facteur6,7.

Cand1 régule la dynamique des ligases de E3 des protéines (SCF) Skp1•Cul1•F-box, qui appartiennent à la grande famille d’ubiquitine ligases de Cullin-RING. Les CCS comprennent le cullin Cul1, qui se lie à la protéine de domaine RING Rbx1, et une protéine F-box interchangeable, qui recrute des substrats et lie Cul1 par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Skp18. Comme une ligase E3, SCF catalyse la conjugaison de l’ubiquitine sur son support, et il est activé lorsque le substrat est recruté par la protéine F-box et lorsque Cul1 est modifié par l’ubiquitine-comme la protéine Nedd89. Cand1 lie Cul1 non modifié, et lors de la liaison, il perturbe tant l’association de la protéine Skp1•F-box avec Cul1 que la conjugaison de Nedd8 Cul110,11,12,13. Ainsi, Cand1 semble être un inhibiteur de l’activité in vitro SCF, mais une carence en Cand1 dans les organismes causé défauts qui suggère un rôle positif de Cand1 dans la régulation des activités SCF dans vivo14,15,16 , 17. ce paradoxe a enfin expliqué par une étude quantitative qui a révélé les interactions dynamiques entre les protéines Cul1, Cand1 et Skp1•F-box. Utilisant la fluorescence resonance energy transfert (FRET) de détecter la formation de l’EFC et Cul1•Cand1 complexes, l’association et dissociation constantes de vitesse (ksur et koff, respectivement) ont été mesurée individuellement. Les mesures ont révélé que fois Cand1 et Skp1•F-boîte forme extrêmement serré complexe protéique avec Cul1, mais le khors du SCF est considérablement augmenté par Cand1 et augmente considérablement la khors de Cul1•Cand1 par Skp1•F-case protéine6,7. Ces résultats fournissent la prise en charge initiale et critique pour définir le rôle de Cand1 comme un facteur d’échange de protéine, qui catalyse la formation de nouveaux complexes SCF grâce au recyclage Cul1 depuis les vieux complexes SCF.

Ici, nous présentons la procédure de développement et l’utilisation de l’essai de frette pour étudier la dynamique du complexe Cul1•Cand17, et le même principe peut être appliqué afin d’étudier la dynamique des diverses biomolécules. FRETTE se produit lorsqu’un donneur est excité par la longueur d’onde appropriée et un accepteur avec spectre d’excitation qui se chevauchent le spectre d’émission de donneur est présent dans un rayon de 10-100 Å. L’état excité est transféré à l’accepteur, ce qui diminue l’intensité des donateurs et augmentant l’accepteur intensité18. L’efficacité du FRET (E) dépend de la distance entre les fluorophores donneur et accepteur (r) et le rayon de Förster (R,0) et est définie par : E = R06/ (R0 6 + r6). Le rayon de Förster (R0) dépend de quelques facteurs, y compris l’orientation angulaire du dipôle, le chevauchement spectral de la paire de donneur-accepteur et la solution utilisé19. Pour appliquer le test FRET sur un fluorimètre flux stoppé, qui surveille le changement de l’émission du donneur en temps réel et permet des mesures rapides ksur et koff, il est nécessaire d’établir la frette efficace qui entraîne une réduction significative des émissions de donateurs. Par conséquent, conception efficace frette en choisissant la paire appropriée de colorants fluorescents et sites sur les protéines cibles pour fixer les teintures est importante et est discutée dans le présent protocole.

Protocol

1. conception de l’essai de la frette. Télécharger le fichier de structure de la Cul1•Cand1 complexe de la Protein Data Bank (fichier 1U6G). Afficher la structure de la Cul1•Cand1 complexe à PyMOL. Utilisez la fonction de mesure sous le menu Assistant de PyMOL pour estimer la distance entre le premier acide aminé de Cand1 et le dernier acide aminé de Cul1 (Figure 1). Charger le spectateur de spectres en lign…

Representative Results

Pour tester la frette entre Cul1AMC et FlAsHCand1, nous avons d’abord déterminé l’intensité des émissions de 70 nM Cul1AMC (le donateur) et 70 nM Cand1 FlAsH(accepteur), respectivement (Figure 3 a-C, bleu lignes). Dans chaque analyse, seulement un pic d’émission était présent et l’émission de FlAsHCand1 (accepteur) était faible. Lorsque 70 nM chaque de Cul1AMC …

Discussion

FRETTE est un phénomène physique qui est d’un grand intérêt pour l’étude et la compréhension des systèmes biologiques,19. Nous présentons ici un protocole pour les essais et à l’aide de frette pour étudier la cinétique de la liaison de deux protéines qui interagissent. Lorsque vous concevez la frette, nous avons examiné trois facteurs principaux : le recouvrement spectral entre donneur d’émission et accepteur d’excitation, la distance entre les deux fluorophores et l’ori…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Shan Shu-UO (California Institute of Technology) pour discussion perspicace sur le développement de l’essai de la frette. M.G. et Y.Z. X.L. ont été financés par des fonds de démarrage de l’Université Purdue à Y.Z. et X.L.This a été financée en partie par une subvention de démarrage de Purdue University Center dans biologie végétale.

Materials

Anion exchange chromatography column GE Healthcare 17505301 HiTrap Q FF anion exchange chromatography column
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf 2231000511
BL21 (DE3) Competent Cells ThermoFisher Scientific C600003
Calcium Chloride Fisher Scientific C78-500
Cation exchange chromatography column GE Healthcare 17505401 HiTrap SP Sepharose FF
Desalting Column GE Healthcare 17085101
Floor model centrifuge (high speed) Beckman Coulter J2-MC
Floor model centrifuge (low speed) Beckman Coulter J6-MI
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax fluorimeter HORIBA FluoroMax-3
FPLC GE Healthcare 29018224
GGGGAMC peptide New England Peptide custom synthesis
Glutathione beads GE Healthcare 17075605
Glycerol Fisher Scientific G33-500
HEPES Fisher Scientific BP310-100
Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Fisher Scientific 15-529-019
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Ovalbumin MilliporeSigma A2512
pGEX-4T-2 vector GE Healthcare 28954550
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma 4693132001
Reduced glutathione Fisher Scientific BP25211
Refrigerated shaker Eppendorf M1282-0004
Rosetta Competent Cells MilliporeSigma 70953-3
Size exclusion chromatography column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 10/300 GL column
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Stopped-flow fluorimeter Hi-Tech Scientific SF-61 DX2
TCEP·HCl Fisher Scientific PI20490
Thrombin MilliporeSigma T4648
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Ultrafiltration membrane MilliporeSigma UFC903008 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL

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Diesen Artikel zitieren
Garsamo, M., Zhou, Y., Liu, X. Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale. J. Vis. Exp. (145), e59038, doi:10.3791/59038 (2019).

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