Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil
Summary
El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.
Abstract
El estudio de las relaciones del sustrato de la quinasa es esencial tener una comprensión completa de las funciones de estas enzimas y sus objetivos downstream en Estados fisiológicos y patológicos. CK2 es una cinasa serina/treonina evolutivamente conservados con una creciente lista de centenares de sustratos implicados en múltiples procesos celulares. Debido a sus propiedades pleiotrópicos, identificar y caracterizar un conjunto amplio de sustratos de CK2 ha sido particularmente difícil y sigue siendo un obstáculo en el estudio de esta enzima importante. Para abordar este desafío, hemos ideado una estrategia experimental versátil que permite el enriquecimiento objetivo e identificación de posibles sustratos de CK2. Este protocolo aprovecha de la especificidad de sustrato Co dual única de CK2 permitiendo thiophosphorylation específico de sus sustratos en una célula o tejido lisado. Estas proteínas de sustrato son posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por líquido cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS). Previamente hemos utilizado este enfoque para identificar con éxito CK2 sustratos de Drosophila ovarios y aquí extendemos la aplicación del presente Protocolo a las células de glioblastoma humano, ilustrando la capacidad de adaptación de este método para investigar la funciones biológicas de esta quinasa en diversos organismos modelo y sistemas experimentales.
Introduction
Proteínas quinasas son componentes clave de cascadas de transducción de la señal. Fosforilación de las proteínas sustrato de estas enzimas produce respuestas biológicas que regulan eventos críticos que controla la división celular, el metabolismo y la diferenciación, entre otros. CK2 es una quinasa de serina/treonina ubicuo expresada, acidófilos que se conserva de la levadura a los seres humanos y que juega un papel importante en muchos procesos celulares que van desde la regulación transcripcional de la progresión del ciclo celular apoptosis1 ,2,3. La enzima es un heterotetrámero compuesto de dos α catalítica (o α’) subunidades y dos subunidades β regulador4. Además de ser muy pleiotrópico, CK2 exhibe dos otras características inusuales que complican su análisis, es decir, actividad constitutiva5 y de la especificidad de sustrato Co doble6. Esta última propiedad dota la habilidad de usar GTP y ATP para la fosforilación de las proteínas sustrato de CK2.
Supresión genética de las subunidades catalíticas o reglamentarias de CK2 en ratones produce mortalidad embrionaria que indica que desempeña papeles cruciales durante el desarrollo y organogénesis7,8. CK2 también se sobreexpresa en varios tipos de cáncer y representa una prometedora diana terapéutica9,10,11. De hecho, inhibidores específicos quinasa CK2 de destino están actualmente bajo investigación para este propósito12,13,14. Mientras que la inhibición de la CK2 es una opción viable, dada su carácter pleiotrópico, alternativa y quizás más racional sería objetivo crítico sustratos CK2 que subyacen a la progresión de ciertos tipos de cáncer. Por lo tanto, la completa identificación y caracterización de proteínas de sustrato de CK2 sería un beneficio significativo para dilucidar las funciones específicas de esta quinasa en un tipo particular de tejido o tumor.
Aquí, describimos un método versátil bioquímico para la identificación de sustratos de CK2 de una muestra biológica compleja como una célula o un tejido lisado. Este protocolo toma ventaja de la especificidad de sustrato Co dual de CK2 utilizando el análogo del GTP GTPγS (5′-[γ-thio]triphosphate) de guanosina que otras quinasas endógenas no pueden utilizar. Esto permite con eficacia la quinasa a sus substratos dentro de esta muestra para posterior aislamiento e identificación de la “etiqueta”.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método bioquímico relativamente simple para la identificación de sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja. Los pasos críticos de este protocolo se basan en las propiedades enzimáticas inusuales de CK2 e incluyen thiophosphorylation CK2 dependiente de las proteínas sustrato específico utilizando GTPγS y su posterior inmunoprecipitación e identificación. Con estos resultados, hemos demostrado la utilidad y versatilidad de este enfoque como ahora hemos…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por una beca de la Commonwealth mejora Universal de investigación del Departamento de salud de Pennsylvania a T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
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