다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별
Summary
이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.
Abstract
키 기판 관계의 연구는 이러한 효소와 생리 및 병 적인 상태에서 그들의 다운스트림 목표의 기능에 대 한 완전 한 이해를 얻기 위해 필수적 이다. CK2 여러 세포질 과정에서 포함 된 기판의 수백의 성장 목록을 진화론 보존된 떠들고/트레오닌 키 니 아 제 이다. 다 면 발현 성 속성으로 인해 식별 및 CK2 기판의 종합 세트 특히 도전 하고있다 고이 중요 한 효소의 연구에서 장애물을 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 대상된 농축 및 상 상속 CK2 기판의 식별을 가능 하 게 하는 다양 한 실험적인 전략을 고안 했다. 이 프로토콜은 lysate 셀 또는 조직에는 기판의 특정 thiophosphorylation에 대 한 허용 CK2의 독특한 듀얼 공동 기질 특이성을 활용 합니다. 이러한 기판 단백질은 이후에 alkylated, immunoprecipitated, 및 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)에 의해 식별. 우리는 이전 CK2 기판 초파리 난소에서 성공적으로 식별 하이 접근을 사용 하 고 여기 우리가 조사를이 방법의 적응성을 보여주는 인간 세포종 세포에이 프로토콜의 응용 프로그램을 확장 합니다 다양 한 모형 유기 체 및 실험적인 시스템에이 키의 생물학 역할.
Introduction
단백질 kinases는 신호 변환 폭포의 핵심 요소입니다. 이 효소에 의해 기질 단백질의 인 산화는 세포 분열, 물질 대사, 및 다른 사람의 사이에서 분화 하는 중요 한 이벤트를 규제 하는 생물학 응답 elicits. CK2 편 표현, acidophilic 떠들고/트레오닌 키 니 아 하이 인 간에 게 효 모에서 보존 하 고는 transcriptional 규칙에서 apoptosis1 세포 주기 진행에 이르기까지 많은 세포질 과정에 중요 한 역할은 2,3. 효소는 2 개의 촉매 α의 구성 하는 heterotetramer (또는 α’) 소 단위 및 2 개의 규제 β 소 단위4. 매우 다 면 발현 성 덧붙여 CK2 두 다른 특이 한 특성의 분석을 복잡 하 게 하는 즉 제정 활동5 와 듀얼 공동 기질 특이성6전시 한다. 이 후자의 속성 기질 단백질의 인 산화에 대 한 ATP로 서 GTP를 사용 하는 기능 CK2 endows.
쥐에서 CK2의 촉매 또는 규제 subunits의 유전 삭제 결과 그것은 개발 및 organogenesis7,8동안 중요 한 역할을 재생을 나타내는 배아 치 사 율. CK2 또한 여러 가지 유형의 암 overexpressed 고 따라서 유망 치료 대상9,,1011를 나타냅니다. 실제로, 특정 억제제 대상 CK2 키 니 아 제 활동은 현재이 목적12,,1314에 대 한 조사를 받고. 동안 억제 CK2의 가능한 옵션을 주어진 다 면 발현 성 자연, 대안 이며 아마도 더 합리적인 접근의 특정 암 진행의 기반이 되는 중요 한 CK2 기판 대상 하는 것. 따라서, 포괄적인 신분증과 CK2 기질 단백질의 특정 조직이 나 종양 유형 내에서이 키의 특정 함수를 elucidating 상당한 이점 될 것 이다.
여기, 우리는 셀 또는 조직 lysate 복잡 한 생물학 견본에서 CK2 기판 식별에 대 한 다양 한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜은 GTP 아날로그 (guanosine 5′-[γ-thio]triphosphate) 다른 생 kinases 사용할 수 없습니다 GTPγS의 사용에 의해 CK2의 듀얼 공동 기질 특이성을 이용. 효과적으로 “레이블” 후속 격리 및 식별에 대 한이 예제 내에서 기판 하 니 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 복잡 한 생물학 견본에서 단백질 키 니 아 제 CK2의 기질을 식별 하는 데 상대적으로 간단한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜의 중요 한 단계 CK2의 특이 한 효소 속성에 기반 하 고 GTPγS 및 후속 immunoprecipitation 식별을 사용 하 여 특정 기질 단백질의 CK2 종속 thiophosphorylation를 포함 합니다. 이러한 결과 함께 우리 시연 유틸리티와이 접근의 다양성으로 우리가 지금 인간의 세?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 펜실베니아 보건에서 T.I.S.의 연방 보편적인 연구 향상 그랜트에 의해 부분적으로 지원
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
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