Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Weltweit sind Feuchtgebiete schätzungsweise 529 Pg Kohlenstoff (C), enthalten meist als organischen C in Torf Einlagen¹begraben. Derzeit wirken solche Mooren als Netto C Senke, Sequestrierung 29 Tg C y^-1 in Nordamerika allein¹. Jedoch kann ökologische Störungen wie Entwässerung, Brände, Dürre und wärmeren Temperaturen diese C-Senke durch Erhöhung der Abbau organischer Materie, was zu erhöhten C Verluste über Treibhausgas aufgehoben (Kohlendioxid [CO₂] und [CH-₄] Methan) Produktion^1,2. Klimawandel kann zu C beitragen, wenn wärmere Temperaturen oder trockener Bedingungen schneller C Zersetzung durch Mikroorganismen stimuliert. Alternativ können höhere Temperaturen und Luftkonzentrationen CO₂ Primärproduktion um mehr CO₂ als organischem Kohlenstoff (OC) absondern stimulieren. In welchem Umfang und wie schnell diese OC ist dann zerlegt in CO₂ und CH₄ hängt die komplexen Wechselwirkungen zwischen Elektron Spender Substrate, die Verfügbarkeit von Elektronen-Akzeptoren und die Mikroorganismen, die vermitteln die Diese Transformation. In vielen Fällen die Mechanismen sind nicht gut charakterisierten, damit ihre Reaktion auf ökologische Störungen ist nicht gut eingeschränkt und es bleibt unklar, was das Ergebnis des Klimawandels auf die Kohlenstoffbilanz in Mooren Ökosysteme.

Die komplexe Natur der natürlichen organischen Substanz (NOM) hat sogar die organischen Verbindungen im NOM Mischungen historisch schwierig zu identifizieren. Die jüngsten Fortschritte haben unsere Fähigkeit, Verbindungen, traditionell zu charakterisieren und zu einem gewissen Grad als widerspenstige Huminsäuren oder Fulvinsäuren Verbindungen^3,4,5angesehen werden, weiterhin verbessert. Wir verstehen jetzt, dass viele dieser Verbindungen eigentlich mikrobiell verfügbar sind und zerlegt werden, können wenn eine geeignete terminal Elektronen-Akzeptor (Tee) zur Verfügung^{6,7 erfolgt}. Berechnung der nominellen Oxidationsstufe des Kohlenstoffs (NOSC) für eine Verbindung bietet eine Metrik für die Vorhersage des Potenzials für die Zersetzung und die Energieausbeute des Tees erforderlich. Es erfordert jedoch eine Charakterisierung molekularer Ebene der organischen Substanz⁷. NOSC errechnet sich aus der Summenformel über die folgende Gleichung⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, wo z der Nettoladung ist. NOSC korreliert mit der thermodynamischen treibende Kraft⁸, wobei Verbindungen mit höheren NOSC leichter sind zu verschlechtern, während Verbindungen mit niedriger NOSC bedürfen zu ihrer zunehmend energetische Tees reduziert werden. Verbindungen mit weniger als −2 NOSC erfordern eine hohe Energie Gewinnung Tees wie O₂, Nitrat oder Mn^IV, und kann nicht abgebaut werden, durch die häufig auftretenden niedriger Energie Gewinnung Teesorten wie Fe^III oder Sulfat-⁷. Dies ist ein wichtiger Aspekt in den aufgeweichten anoxischen Bedingungen in Feuchtgebiete, wo O₂ und andere hochenergetische nachgeben Tees knapp^{9 sind} und deshalb der Abbau von niedrigeren NOSC Verbindungen unter diesen Bedingungen thermodynamisch begrenzt. Ökologische Störung beeinflussen den thermodynamischen Zustand des Ökosystems durch hydrologische Veränderungen, die Einfluss auf O₂ (die energiereichsten Elektronen-Akzeptor), Veränderungen der organischen Substraten und Elektronen-Akzeptoren zur Verfügung gestellt, von primären Produktion, und in geringerem Maße von der Temperatur. Ein wichtiges Beispiel für die Temperatureffekte in Feuchtgebieten Systemen tritt in Bezug auf die Trade-off zwischen Homoacetogenesis (d.h., Acetat-Produktion von CO₂ und H₂) und Hydrogenotrophic () Methanogenese tritt d. h., CH₄ Produktion von CO₂ und H₂). Bei niedrigen Temperaturen scheint es, dass Homoacetogenesis etwas begünstigt wird, während wärmere Temperaturen CH₄ Produktion¹⁰bevorzugen. Diese Temperatur kann wichtige Implikationen für die Reaktion von Ökosystemen zu wechselnden Klima, wirken wie CH₄ Treibhausgas ist viel stärker als CO₂¹¹ und damit Steigerung der Produktion von CH₄ auf Kosten des CO₂ bei wärmeren Temperaturen kann auf ein positives Feedback mit Erwärmung des Klimas beitragen.

Mooren produzieren weltweit bedeutende Mengen von CO₂ und CH₄⁶über mikrobielle Atmung von natürlich vorkommendem organische Materie. Die NOSC der organischen Kohlenstoff Substrate bestimmt den relativen Anteil der CO₂: CH₄ hergestellt, was ein kritischer Parameter aufgrund der höheren Strahlungsantriebs CH₄ im Vergleich zu CO₂¹¹, sondern auch, weil Modellierung Bemühungen haben dieses Verhältnis als ein kritischer Parameter für die Schätzung der C Flussmittel in Mooren¹²identifiziert. In Abwesenheit von terminal Elektronen Akzeptoren als CO₂, es kann durch Elektron Balance gezeigt werden, dass Bio C Substrate mit NOSC > 0 wird CO-₂produzieren: CH₄ > 1, Bio C mit NOSC = 0 produziert CO₂ und CH₄ in äquimolaren Verhältnis und Bio C mit NOSC erzeugt < 1 CO₂: CH₄ < 1¹³. Zersetzung von OC in natürlichen Ökosystemen wird durch Mikroorganismen, vermittelt, so dass auch beim Abbau eines bestimmten Stoffes thermodynamisch möglich ist, es kinetisch durch die Aktivität der mikrobiellen Enzyme und unter anoxischen Bedingungen von begrenzt ist die thermodynamische Antriebskraft (d.h.NOSC)⁷. Bis jetzt hat es schwierig, um die organische Substanz vollständig zu charakterisieren, da die Vielfalt der Verbindungen, die verschiedenen komplementäre Techniken für deren Charakterisierung erfordert. Die jüngsten Fortschritte haben die Lücke geschlossen; mit einer Suite von analytischen Techniken können wir eine Vielzahl von organischen Verbindungen, die Bereitstellung von Charakterisierung molekularer Ebene und in einigen Fällen Quantifizierung von kleinen primären Metaboliten wie Glukose bis zu 800 Da Poly-Heterozyklen analysieren. Zuvor würde so große komplexe Moleküle einfach als Lignin-ähnliche oder Tannin-Like und angenommenen widerspenstigen gewesen zu sein geprägt haben. Charakterisierung der molekularen Ebene, ermöglicht jedoch die Berechnung der NOSC für selbst diese große komplexe Moleküle. Diese NOSC Werte sind linear korreliert mit der thermodynamischen Motor ermöglicht eine Beurteilung der Qualität von organischem Material zur Zersetzung, die in vielen Fällen zeigt, dass diese komplexe Moleküle tatsächlich mikrobiell sein kann abbaubare auch unter anoxischen Bedingungen, die in den Feuchtgebieten herrschen.

Seit Einführung von O₂ organischen Substanz von fast allen natürlich NOSC Beobachtungswerte zerlegt werden kann, konzentrieren hier wir uns auf Veränderungen in der organischen Substanz und mikrobielle Proteomics Haupttreiber im Feuchtgebiet (d. h., sein dürften begrenzte O₂) Systeme. Jedoch können die Techniken, die wir besprechen auf organischer Substanz aus jedem Ökosystem angewendet werden. Allgemein, Bulk Messungen basierend auf optischen und Fluoreszenz-Analysen wurden verwendet, um organische Substanz Qualität^3,14zu beurteilen. Bei der Verwendung von Bulk-Messungen wie diese sind feine Details verloren wie die große Zahl von Molekülen zusammen unter Oberbegriffe wie Humics oder Fulvics kategorisiert werden. Die Definitionen dieser Kategorien sind nicht gut eingeschränkt und in der Tat variieren von Studie zu Studie machen Vergleiche unmöglich. Weiter, Bulk-Messungen nicht die molekularen Details zur Berechnung der Thermodynamik für das System und daher wirklich Beurteilung organischer Qualität¹⁵zurückbleiben.

Einzeltechniken wie Fourier transformieren Ion Cyclotron Resonance Massenspektrometrie (FTICR-MS), Kernresonanzspektroskopie (NMR), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) tun Geben Sie die Details solcher molekularer Ebene. Während jede dieser Techniken seine eigenen Grenzen präsentiert, bringen sie auch ihre eigenen Stärken, die in einem integrierten Ansatz zu molekularen Details zur Quantifizierung organischer Qualität in einem rigorosen thermodynamischen Sinne notwendig genutzt werden können . GC-MS ist nützlich zur Identifikation von kritischen kleine Metaboliten, die voraussichtlich proximalen Einfluss auf CO₂ und CH₄ Produktion (z. B.Glukose, Acetat, etc.); jedoch, GC-MS erfordert Überprüfung gegen einen Standard und beschränkt sich daher auf bereits bekannte Verbindungen, die in der Datenbank, die Identifizierung der neuartige Substanzen zu verhindern. GC-MS ist eine semi-qualitative Technik erlaubt Rückschlüsse über die Veränderungen im relativen Konzentrationen, aber nicht der Information tatsächliche Konzentration notwendig für die Berechnung der Gibb freie Energien zum Beispiel. Zu guter Letzt GC-MS erfordert Derivatisierung von Molekülen vor der Analyse die Auflösung kleiner als ~ 400 Da Verbindungen begrenzt und flüchtige Alkohole sind verloren während der Trocknung.

Eindimensionale (1D) ¹H flüssigen Zustand NMR ermöglicht hoch quantitative Charakterisierung der kleinen Metaboliten (einschließlich primäre kleines Molekulargewicht Metaboliten und flüchtigen Stoffen wie Alkohole, Acetat, Aceton, Formiat, Pyruvat, Succinat, kurzkettige Fettsäuren, sowie eine Reihe von Kohlenhydraten notorisch abwesend oder gefährdete aus MS-basierte Methoden) und deren Konzentrationen sind besonders nützlich für die Berechnung der thermodynamischen Parameter. Doch wie GC-MS, 1D NMR von komplexen Gemischen erfordert Standardisierung im Vergleich zu einer Datenbank und daher nicht allein erlauben einfache Identifizierung von neuartigen Verbindungen, die reich an komplexen Natur- und veränderten Ökosysteme sein dürften. Darüber hinaus NMR ist unempfindlicher als die MS-basierte Techniken und Profilierung quantitative Metabolit daher erst ab 1 µM mit NMR-Systeme ausgestattet mit Helium gekühlt Kälte-Sonden erreicht ist. Nicht weithin geschätzt, einige NMR Kälte-Sonden sind salztoleranten und ökologischen Mischung Analyse im Beisein von millimolaren Salzkonzentrationen bei Verwendung in kleineren Durchmesser (< 3 mm Außendurchmesser) Probe Rohre¹⁶ermöglichen. Eine weitere Komplikation der NMR ist jedoch, dass hohe Mengen an paramagnetischen Metalle und Mineralien (z.B.Fe und Mn über 1-3 wt %(), die reichlich in Hochland Böden lässt, können spektrale Funktionen zu erweitern und erschweren die Interpretation von NMR-Spektren . Mit Festphasenextraktion (SPE) können Hilfe bei der Interpretation von NMR und MS-basierte Metabolomik Methoden durch die Verringerung der Mineralsalze und spektrale Qualitätssteigerung.

FTICR-MS durch direkte Injektion ist eine hochsensible Technik in der Lage, Zehntausende von Metaboliten aus einer einzigen Probe zu erkennen, aber es erfasst nicht die kritische kleine Metaboliten wie Acetat, Pyruvat und Succinat und ist notorisch schwierig zu Verwenden Sie für Zucker und andere Kohlenhydrate¹⁷, noch enthält es quantitative Angaben. Jedoch im Gegensatz zu den anderen Techniken FTICR-MS zeichnet sich bei identifizieren und neuartige Substanzen Molekulare Formel zuweisen und somit die größte Anzahl an Verbindungen mehr molekularen Informationen als alle anderen beschriebenen Techniken identifiziert. Dies ist nützlich, weil die molekularen Informationen FTICR-MS (und andere Techniken) verwendet werden kann, um NOSC zu berechnen, bezogen auf die thermodynamische Antriebskraft für die Wahrscheinlichkeit, dass bestimmte Reaktionen⁸ und ihre Preise unter bestimmten Bedingungen-⁷. Darüber hinaus kann durch die Kopplung von FTICR-MS mit Trennverfahren, wie z. B. LC zusammen mit Tandem MS, quantitative Strukturinformationen erreicht werden versetzen einige der Nachteile dieser Technik. LC-MS ist nützlich zur Identifikation von Lipid-ähnliche Verbindungen und andere Metaboliten, die nicht gut zeichnen sich durch eine der anderen Methoden. Kupplung FTICR LC-MS oder LC-MS mit Fraktionssammler und sammeln von Bruchteilen von bestimmten unbekannten von Interesse für strukturelle Aufklärung durch zweidimensionale (2D) flüssigen Zustand NMR ist die ideale Situation für die Identifizierung und Quantifizierung der unbekannte Verbindungen^{18 ,19}. Dies ist jedoch eine sehr zeitaufwendige Schritt, der verwendet werden könnte, bei Bedarf. Einzeln genommen, jede dieser Techniken bieten eine andere Momentaufnahme der organischen Substanz und von zu integrieren, können wir ein vollständigeres Verständnis als die Verwendung einer der Techniken isoliert.

Während die thermodynamischen Überlegungen die ultimative Einschränkungen stellen für welche Transformationen in einem System möglich sind, ist Abbau organischer Materie durch Mikroorganismen vermittelt, deren Enzymaktivitäten Reaktionsgeschwindigkeiten steuern. Vollständig zu verstehen, die Steuerelemente am Abbau organischer Materie und letztlich (CO₂ und CH₄) Treibhausgasproduktion aus Feuchtgebieten erfordert daher einen integrierte Omics Ansatz zur Charakterisierung mikrobieller Enzymaktivitäten sowie die Metaboliten. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Erreichung einer umfassenden Analysis von einer einzigen Probe mit einem sequentiellen Ansatz, der eine vollständig gekoppelte Analyse führt. Dieser Ansatz baut auf der Metabolit, Protein und Lipid-Extraktion (MPLex)-Protokoll in der Proteomik mit GC-MS und LC-MS²⁰ kleine Metaboliten, Proteinen und Lipiden zu identifizieren, durch die Einbeziehung quantitativer Metabolit Informationen gekoppelt war über NMR und Identifizierung von größeren Sekundärmetaboliten über FTICR-Frau etwas anders, MPLex, beginnen wir das Protokoll mit einem Wasserextraktion und dann Verwendung sequentielle Extraktion mit zunehmend unpolaren Lösungsmitteln. Alle Extraktionen erfolgen auf einer einzigen Probe die Probe konserviert, wenn Volumen begrenzt oder schwer zu beschaffen sind und experimentellen Fehler eingeführt durch Unterschiede zwischen den Aliquoten aus heterogenen Stichprobe Matrizen (z.B., Erde und Torf) verringert oder Unterschiede in der Lagerbedingungen und Dauer.

Schließlich können wir durch die Kopplung der OM-Analysen mit Proteomics Analysen der mikrobiellen Gemeinschaft, metabolische Netzwerke aufbauen, die die Wege und die Transformation der Abbau organischer Materie zu beschreiben. Dies ermöglicht uns, testen Sie spezifische Hypothesen, wie Störungen des Systems ultimative CO₂ und CH₄ Produktion durch Änderung der vorhandenen organischen Substrate, Elektronen-Akzeptoren und mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen wird Vermittlung der Reaktionen über die Aktivität des Enzymkatalysatoren.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein einzelnes Durchsatz-Protokoll zur Verfügung stellen für die Analyse von Metaboliten, Lipide und mikrobielle Proteine aus einer einzigen Probe, wodurch eine vollständig gekoppelte Dataset für metabolische Netzwerke aufzubauen, während analytische Fehler einschränken .