JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

Производство Pseudotyped частиц для изучения патогенного коронавирус в условиях 2-го уровня биобезопасности

Published: March 01, 2019
doi:
10.3791/59010
, , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine,Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences,Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center,University of Massachusetts Medical School

Summary

Здесь мы представляем протокол для создания pseudotyped частиц в обстановке BSL-2, включающих Спайк белка высоко патогенные вирусы Ближнего Востока респираторного синдрома и тяжелый острый респираторный синдром коронавирус. Эти pseudotyped частицы содержат Люцифераза Репортер ген, позволяя количественного определения вирусов вступления в целевые клетки хозяина.

Abstract

Протокол призван генерировать коронавирус (CoV) Спайк (S) синтез белка pseudotyped частиц с мышиных лейкемии Вирус (МЛВ) ядро и Люцифераза репортер, используя простой трансфекции процедура широко доступны ГЭС 293T клеток линии. После того, как формируется и освобождены от производителя клетки, эти pseudovirions включают Люцифераза Репортер ген. Так как они содержат только гетерологичных коронавирус Спайк белка на их поверхности, частицы ведут себя как их родной коронавирус коллегами для записи шагов. Таким образом они являются отличным суррогаты родной вирионы для изучения вирусной вступления в клетки хозяина. После успешного входа и инфекции в клетки-мишени репортер Люцифераза получает интегрированы в геном клетки хост и выражается. С помощью простой Люцифераза пробирного, transduced клетки могут быть легко количественно. Важным преимуществом процедуры является, что она может быть выполнена в области биобезопасности уровня 2 зал (BSL-2) вместо BSL-3 объекты, необходимые для работы с высоко патогенного коронавирус, таких, как Ближний Восток респираторный синдром коронавирус (РВК-CoV) и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (атипичной пневмонии-CoV). Еще одно преимущество происходит от его универсальность, как он может быть применен к конверт белков, принадлежащих всех трех классов вирусных синтез белков, таких как класс я гриппа гемагглютинина (HA) и Эбола вирус гликопротеина (GP), вирус лес Семлики II класса E1 белок, или гликопротеина G вирус везикулярного стоматита III класса. Ограничением методологии является, что она может только резюмировать вирус вход шаги при посредничестве конверт белков проводится расследование. Для изучения других вирусных жизненного цикла действия, требуются другие методы. Многие приложения, которые эти псевдотипов частицы могут быть использованы в примеры расследований принимающей ячейки восприимчивость и тропизма и тестирования эффекты ингибиторов вирус вход для того чтобы рассечь вирусный вход пути используется.

Introduction

Запись узла клеток представляет собой первоначальные шаги вирусных инфекционных жизненного цикла. Для оболочечных вирусов это включает связывание с рецепторами клеток одного узла или нескольких рецепторов, а затем сочетание вирусных и клеточных мембран. Эти основные функции осуществляются вирусный конверт гликопротеинов1,2. Коронавирус гликопротеина оболочки называется белка Спайк (S) и является членом класса я вирусный синтез белков2,3,4,5,6. Изучая вирусный конверт гликопротеинов имеет решающее значение для понимания многих важных характеристик данного вируса, такие как: начало жизненного цикла, его хост и клеточного тропизма, Межвидовая передача, вирусный патогенеза, а также принимающей ячейки записи пути. Вирусный pseudotyped частиц, также названный pseudovirions, являются мощными инструментами, которые позволяют нам легко изучить функции вирусных синтеза белков. Pseudotyped частицы или pseudovirions являются химерных вирионы, которые состоят из суррогатного вирусный ядро с гетерологичных вирусный конверт белков на их поверхности. Основной целью протокола является показать, как получить коронавирус шип pseudotyped частицы, которые основаны на ядре мышиных лейкемии Вирус (МЛВ) и содержат Люцифераза Репортер ген. Представлены примеры, способ получения pseudotyped частиц с белками Спайк высоко патогенного тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) и Ближнего Востока коронавирус респираторного синдрома (РВК). Протокол описывает трансфекции процедур, как заразить восприимчивы целевой ячейки и количественная оценка инфективности Люцифераза assay.

Поскольку запись шаги pseudovirions регулируются коронавирус S на их поверхности, они введите клетки аналогичным образом исходными аналогами. Как таковые они являются отличным суррогаты функциональных инфективности анализов. Pseudotyped частицы обычно являются производными от родительской модели вирусов, таких как ретровирусы (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 и вирус иммунодефицита человека — ВИЧ23,24,25,26,27,,2829 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) или rhabdoviruses (вирус везикулярного стоматита — VSV36,39,40,41,42,,4344 , 45 , 46 , 47). при использовании в pseudotyping, геномов родителей вирусов изменяются для удаления важно генов, делая их дефектных для выполнения цикла полной репликации. Эта функция позволяет им использоваться в промежуточном биобезопасности уровня удобства (BSL-2) и является важным преимуществом над использованием родной высоко патогенные вирусы, которые требуют больше удобства биобезопасности (BSL-3, BSL-4, который не так легко доступны) при проведение исследований вирус вход. Здесь, S белки риска группы 3 возбудителей ОРВИ-CoV и РВК-CoV используются в качестве примеров вирусного конверт белков, включаются в MLV pseudotyped частицы, генерации ТОРС-CoV S и S РВК-CoV pseudovirions (атипичной пневмонии-Spp и РВК-Spp, соответственно). Эти pseudovirions были успешно использованы в исследованиях, посвященных запись событий эти вирусы48,49,,5051. Еще одним преимуществом является, что метод, описанный здесь не ограничивается pseudotyping коронавирус S белки: она является очень гибким и может использоваться для включения представителей всех трех классов вирусных синтеза белков. Примеры включают гриппа гемагглютинина (га, класс I)52, гликопротеин вирус Эбола (GP класса I), E1 белков вируса Семлики лес альфавирус (SFV, класс II), и VSV гликопротеина (G, класс III)53. Кроме того, более чем один вид вирусных гликопротеина может быть совместно включены в pseudotyped частицы, как и в случае с гриппа ха-NA – pseudotyped частиц51.

Опираясь на работы, выполняемые Бартошем et al.20, этот протокол описывает поколения MLV pseudotyped частиц с трех плазмида Сопредседатель трансфекции стратегии, с помощью широко доступных и высококомпетентных transfection ГЭС 293T клеток линии 54. Первый плазмид кодирует MLV основных генов кляп и ГСМ , но не хватает MLV конверт env гена. Второй плазмида является передача вектор, который кодирует Светлячок Люцифераза Репортер ген, сигнал упаковки MLV Ψ-РНК, наряду с 5′- и 3′-фланговые MLV долго терминала повторить (LTR) регионах. Третий плазмида кодирует протеин сплавливания интереса, в этом случае либо ТОРС-CoV S или S РВК-CoV белок. После совместного трансфекции трех плазмид, с помощью трансфекции реагента вирусной РНК и белков получить выразил в пределах transfected клеток, позволяя поколения pseudotyped частиц. С MLV используется в качестве pseudovirion, это происходит на плазматической мембраны: РНК, содержащие Люцифераза гена репортера и упаковки сигнал получить инкапсулирован в зарождающейся частицы, которые также включают плазматической мембраны выразил коронавирус Спайк белки. Частицы, которые бутон из клетки содержат белок коронавирус S на их поверхности и собирают для использования в инфективности анализов. Потому что pseudotyped частицы гавани коронавирус S белков и не MLV конверт белков, когда используется для заражения клеток, они ведут себя как их родной коронавирус коллегами для записи шагов. Вирусной РНК содержащие Люцифераза репортер и фланговые л затем выпущен в ячейке и антиретровирусным полимеразы мероприятия позволяют его обратная транскрипция ДНК и интеграции в геном клетки хост. Количественная оценка инфекционности вирусных pseudotyped частиц в инфицированных клетках затем выполняется с простой Люцифераза активности assay. Поскольку последовательность ДНК, которая получает интегрированы в геном клетки хост содержит только Люцифераза гена и никто из MLV или коронавирус генов белков кодирования, они изначально безопаснее использовать чем репликации компетентных родной вирусов.

Помимо того, что более безопасных заменителей и хорошо адаптируется к позволить включение различных видов конвертов гликопротеинов, pseudotyped частиц, описанные здесь также весьма разносторонни и может использоваться для изучения многих аспектов въезда вирус. Это включает, но не ограничивается: тестирование принимающей ячейки восприимчивость к инфекции вируса, анализ клеточных запись пути использует оболочечных вирусов, изучение воздействия фармакологических ингибиторы и наркотиков показы, проведение нейтрализации антител анализы, характеризующие принимающей ячейки вход оболочечных вирусов, которые не могут быть культивировали и генерации вирусных векторов для доставки генов, стабильных клеточных экспрессии генов интерес, или заставлять замолчать гена.

Protocol

1. ячейка посева для производства Pseudotyped частиц Примечание: Выполните этот шаг в кабинете биобезопасности. Стандартная ячейка культуры методами, получить вырожденная 75 см2 флакон 80 – 90% клеток ГЭС 293T/17, пассированные в полной Дульбекко среднего изменения орла (DMEM-C), содержащей 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС), 10 мм 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) -1- piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), пенициллин 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицина. Подготовка среднего DMEM-T transfections (его состав такой же как DMEM-C, но без антибиотиков). Вымыть клетки с 10 мл из подогретым (37 ° C) Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS) дважды.Примечание: Ручка HEK293T/17 клетки с осторожностью, как они легко отсоединить. Аспирационная супернатант и отсоединение клеток в 1 мл 0,25% раствор трипсина предварительно нагревают при 37 ° C. Место колбу клеток при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора 3−5 минут или пока клетки начинают отсоединение.Примечание: Избегайте инкубации клеток с трипсином для более чем 5 мин, как это обычно приводит к ячейке слипания. Деактивируйте трипсина, добавив 4 мл DMEM-C средне и количество клеток с использованием клеток подсчета слайдов и световой микроскоп.Примечание: Чтобы избежать необходимости считать слишком много ячеек, дополнительного разбавления шаг может потребоваться заранее. Помните, чтобы фактор в этом разбавления, при расчете фактической клеток плотность trypsinized клеток. Разбавить клетки до 5 x 105 клеток/мл с DMEM-C. Семян 6-ну тканевые культуры плита с 2 мл раствора клеток в колодец и осторожно двигаться пластину взад и вперед и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки, избегая круговое движение.Примечание: Это ключевой шаг. Равномерно клетки будет гарантировать, что клетки не комок в центре скважин. В свою очередь, это позволит обеспечить хорошее трансфекции эффективность и pseudotyped частиц производства. Инкубируйте пластину на ночь (16 – 18 ч) при 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатора. 2. три плазмида Сопредседатель transfection Примечание: Выполните этот шаг в кабинете биобезопасности. Соблюдайте клетки под Перевернутый световой микроскоп для проверки морфологии клеток и плотности.Примечание: В идеале плотность клеток должно быть в диапазоне 40 – 60% confluency. Важно, что клетки являются не слишком притока (80−90% притока), ни слишком редко распространяется (20−30% притока) в каждой скважине. Плотность клеток 40−60% confluency обеспечит хорошее pseudotyped частицы производства. Плазмиды микс Вычислите плазмида смесь для каждого конверта гликопротеина после количеств для одной скважиной 6-ну пластины, показанные в таблице 1. Умножение величин, если transfecting несколько скважин и включают дополнительные хорошо чтобы избежать исчерпания смеси.Примечание: Наряду с ТОРС-CoV S и S РВК-CoV кодирования плазмид, включают в себя пустой вектор управления для генерации частиц отрицательного контроля, которые такие, как отсутствие гликопротеинов (Δenv частицы) вирусный конверт вместе с позитивного управления гликопротеин везикулярного стоматит вирус (ВСВ) G гликопротеин, который известен энергично заразить весьма широкий диапазон ячеек (VSV-Gpp). Плазмиды предоставляются по запросу. Mix рассчитанных объемов плазмидов и сокращение сыворотке клетки культуры среднего (см. Таблицу материалы) в пробки microcentrifuge. Реагент на основе липидов трансфекции смесь (см. Таблицу материалы) Рассчитайте объемы для transfection реагент микс от количества, указанные в таблице 2 для одной скважины (1:3 трансфекции соотношение, умножить количествах при необходимости). Включать дополнительных скважин, чтобы избежать исчерпания трансфекции реагент смеси. Mix рассчитаны объемы липидных трансфекции реагента (3 мкл на хорошо) и сокращение сыворотке клетки культуры среднего (47 мкл на хорошо) в microcentrifuge трубку, убедившись в том добавить трансфекции реагента в сокращение сыворотке клеток питательной среды и не другой путь вокруг. Инкубировать обе смеси (для одной скважины: 50 мкл плазмид смешивать и 50 мкл Реагента липидных трансфекции смешивать) отдельно за 5 мин при комнатной температуре. Добавить содержимое смеси реагентов трансфекции плазмид смесь в соотношении 1:1 (для 1 хорошо: 50 мкл каждого микс) Выполнение тщательной закупорить вверх вниз в результате смесь. Инкубируйте смесь для по крайней мере 20 минут при комнатной температуре. Аспирационная отработанного средних клеток. Добавьте нежно 1 мл подогретым (37 ° C) сокращение сыворотке клеток питательной среды на хорошо. Добавить прикапывают 100 мкл трансфекции смеси для каждой скважины.Примечание: Соблюдайте осторожность при добавлении трансфекции смеси в скважины ГЭС 293T как они легко отделить. Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатор для 4-6 ч. Добавить 1 мл на хорошо средних DMEM-T подогретым (37 ° C), которая не содержат антибиотикиПримечание: Это ключевой шаг. Трансфекция реагенты повышают проницаемость клеток и повысить чувствительность к антибиотикам. Для обеспечения эффективности хорошо transfection и производства pseudotyped частиц, важно избегать использования среднего культуры клетки, содержащие антибиотики Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатор для 48 ч. 3. pseudotyped частицы коллекции Примечание: Выполните этот шаг в кабинете биобезопасности. Соблюдайте клетки под Перевернутый световой микроскоп для проверки морфологии клеток и общего состояния. Также проверьте цвет среды, которая должна быть свет розовый/слегка оранжевый.Примечание: Это важный шаг. Если есть слишком много смерти клетки, связанные с трансфекции или средний цвет повернулся оранжевый/желтый (кислой рН), это обычно будет связан с снижения урожайности в инфекционных pseudotyped частиц Трансфер supernatants transfected клеток в 50 мл конические пробирок. Центрифуга для трубы на 290 x g 7 мин для удаления мусора ячейки. Фильтр осветленный supernatants через стерильную 0,45 мкм размера поры фильтра. Сделать маленький объем аликвоты (например., 500 мкл или 1 мл) раствора pseudotyped вируса в криопробирки. Хранить при температуре-80 ° C.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Pseudotyped частицы являются стабильными в-80 ° C в течение многих месяцев, но как только разморозить, избегать повторного замораживания их, как они потеряют инфективности 4. pseudotyped частиц инфекции восприимчивы клеток Примечание: Выполните этот шаг в кабинете биобезопасности. Клетки посева восприимчивы клеток в пластине 24-а Получить путем стандартной ячейки культуры методы 80−90% вырожденная 75 см2 фляги восприимчивы клеток: клеток Веро-E6 для ТОРС-CoV pseudotyped частиц (атипичной пневмонии-Spp) и да-7 клетки для РВК-CoV S pseudotyped частицы (РВК-Spp).Примечание: Чтобы подтвердить инфекционных pseudotyped частиц, которые были произведены, важно тщательно выбирать соответствующие восприимчивы клеточная линия для pseudovirion инфективности анализов. Использование плохо разрешительной клетки приведет к низкой инфективности. Вымойте клетки дважды с 10 мл подогретым (37 ° C) DPBS. Аспирационная супернатант и отсоединение клеток в 1 мл 0,25% раствор трипсина предварительно нагревают при 37 ° C. Место колбу клеток при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора 3−5 минут или пока клетки начинают отсоединение.Примечание: Избегайте инкубации клеток с трипсином для более чем 5 минут, как это обычно приводит к ячейке слипания. Да-7 клетки особенно чувствительны к этому вопросу. Деактивируйте трипсина, добавив DMEM-C средне и количество клеток с использованием клеток подсчета слайдов и световой микроскоп. Разбавить клетки до 5 x 105 клеток/мл с DMEM-C. Семя колодцы 24-хорошо пластины с 0,5 мл раствора клеток в колодец и осторожно двигаться пластину взад и вперед и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки, избегая круговое движениеПримечание: Это ключевой шаг. Равномерно клетки будет гарантировать, что клетки не комок в центре скважин. В свою очередь это позволит обеспечить хорошее инфективности анализов. Для каждого pseudotyped частиц (атипичной пневмонии-Spp, РВК-Spp) и состояния Подготовьте три скважины для трех экспериментальных реплицирует. Включать скважин для неинфицированных (н.и.), пустой вектор Δenv частиц и позитивного управления частицы, такие как VSV-ГПЗ Инкубировать пластину на ночь (16−18 h) в 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатор Pseudotyped частиц инфекции Соблюдать клетки под микроскопом света и визуально подтвердить, что вырожденная ковер клеток. Принесите криопробирки pseudotyped вируса таять на льду. Вымыть клетки три раза с 0,5 мл, предварительно нагретой (37 ° C) DPBSПримечание: Это ключевой шаг. Клетки, которые должным образом не промывать до инфекции обычно приводят к бедным инфективности отсчетов Аспирационная supernatants клетки. Прививать клетки с 200 мкл раствора талой pseudotyped частиц. Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатор для 1−2 h. Добавьте 300 мкл подогретым (37 ° C) среде DMEM-C. Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатор для 72 ч. 5. инфективности квантификации по Люцифераза Assay индикация Примечание: Выполните первые шаги в области биобезопасности кабинета. Оттепель люциферин субстрата (температуре-80 ° C) и 5 x Люцифераза пробирного буфера lysis (хранятся при температуре-20 ° C) пока они достичь комнатной температуры. Разбавьте Люцифераза пробирного литического буфера до 1 x стерильной водой. Аспирационная supernatants клетки, зараженные с pseudotyped частицами. Добавьте 100 мкл буфера lysis Люцифераза пробирного 1 x в каждой скважине. Установите пластину на рокер и Инкубируйте 15 мин с качания при комнатной температуре (с этого момента пластины могут быть обработаны за пределами кабинета биобезопасности). Подготовьте microcentrifuge трубы для каждой скважины, добавив 20 мкл люциферин субстрата в каждой тюбике. Включите люминометра. Выполните измерения активности Люцифераза один хорошо в то время путем передачи 10 мкл lysate одна трубка, содержащая 20 мкл люциферин субстрата. Флик трубки аккуратно перемешать содержимое, но избежать, вытесняя жидкости на стенках трубы. Поместите трубку в устройстве и закройте крышку. Измерьте значение люминесцентные трубки с помощью люминометра. Запишите относительный легкая единица измерения. Повторите шаги 5,8-5.12 пока анализируются все скважины.Примечание: С соответствующим оборудованием, например чтение Люминометр тарелку этот процесс может выполняться автоматически. Assay будет нужно масштабировать до пластины формат (например, 96-луночных пластины). 6. анализ данных Расчет и построение относительной Люцифераза подразделений средних и стандартных отклонений Используйте график построения программного обеспечения для расчета Люцифераза пробирного измерение средних и стандартных отклонений экспериментальной и биологических реплицирует. Печать данных как линейчатая диаграмма с стандартных отклонений.Примечание: При проведении статистического анализа данных, не забудьте включить по меньшей мере три биологических реплицирует в наборах данных.

Representative Results

Представитель результаты анализов инфективности ТОРС-CoV S и S РВК-CoV pseudotyped частицы показано на рисунке 1. Как и ожидалось, для обоих Рисунок 1A и 1 b, VSV G pseudotyped позитивного управления частицы (VSV-Gpp) дал очень высокий средний инфективности в 10 диапазон6 – 107 относительной Люцифераза единиц (RLU) соответственно. Для ТОРС-CoV S pseudotyped частиц (рис. 1А) инфекции восприимчивы клеток Веро-E6, сильный средний инфективности была измерена на примерно 9,8 х 104 RLU. Это значение является почти 3 порядка выше, чем значения измеренных элемента-инфицированных (1.1 x 102 RLU), или Δenv частиц (1,5 х 102 RLU), которые не питают гликопротеинов любой вирусный конверт на их поверхности. Аналогично, для РВК-CoV S pseudotyped частиц (рис. 1Б) инфекции ха-7 клеток, высокий средний инфективности была измерена на около 1,0 x 106 RLU. Это почти 4 порядка выше, чем значения измеренных элемента-инфицированных (0,8 x 102 RLU), или Δenv частиц (2.0 x 102 RLU). Дополнительные инфективности assay была исполнена в котором ТОРС-Spp и РВК-Spp были последовательно разбавленный и используется для заражения клеток Веро-E6 (рисA). Этот assay подтверждает, что действие Люцифераза измеряется зависит от концентрации частиц для заразить клетки. Чтобы подтвердить роль ангиотензин преобразования ферментов 2 (ACE2) и dipeptidyl пептидаза 4 (DPP4), рецепторы ТОРС-CoV и РВК-CoV, соответственно, в посредничестве, вложения и записи pseudotyped частиц, мы использовали плохо разрешительной ГЭС 293T клетки и transfected их выразить ACE2 или DPP4 (рис. 2B). Transfected клеток были затем использованы для assay инфективности. Этот анализ показывает, что по гиперэкспрессии ACE2 и DPP4, есть ~ 4-журнал и ~ 2-журнал рост для ТОРС-Spp и РВК-Spp инфективности, соответственно, подтверждающий что рецептор использование pseudovirions похож на основном вирусов. Приведенные здесь примеры свидетельствуют о важности включая отрицательные (неинфицированных, Δenv частицы) а также положительный контроль (VSV-Gpp) условия при производстве pseudotyped частиц. Действительно частицы положительный контроль VSV-Gpp позволяют нам оценить ли конкретной партии pseudotyped частиц был успешным, уступая функциональных и инфекционный pseudovirions. Ожидаемые результаты типичной инфекции VSV-Gpp частицами в наиболее mammalian клетки линии находятся в диапазоне RLU −107 106. Проблемы с ГЭС 293T/17 производитель клетки (высокий проход номер, проблемы с плотностью клеток) или бедных трансфекции эффективность может повлиять на общую pseudotyped частиц производства и инфективности. Кроме того отрицательный контроль условий также имеют важное значение, поскольку они позволяют нам оценить исходных RLU измерения в конкретной ячейке строки (неинфицированных условие) и неспецифические интернализации частиц (Δenv инфекции), которая не опосредованного на вирусный конверт белков. В идеале для данного типа частицы pseudotyped с вирусной конверт протеин интереса, он рекомендуется для получения значений, которые несколько порядков выше, чем отрицательный контроль значений, как показано в рисунке 1A, B. Однако если для данной ячейки типа pseudotyped вирус дает очень мало инфективности (т.е., закрыть отрицательные элементы управления такие, как показано на рисунке 2B в не transfected Н.Т. условий) это не обязательно означает, что pseudotyped производство частиц был ошибочен. Это может быть что конкретной клетки линии не является или плохо разрешительных к инфекции. Рекомендуется проверить ли тип заданной ячейки ожидается быть восприимчивы к инфекции вируса проводится расследование. Transfecting плохо разрешительной клетки с plasmid(s) выражая вирусных receptor(s) может позволить более эффективные вирусный вход и инфекции происходят, как показано в рисунке 2B, где по transfection ACE2 и DPP4 рецепторов в целевых ГЭС 293T клетки, есть ~ 4- и ~ 2-журнал увеличение инфективности, соответственно. Плазмиды/реагент Количество pCMV-MLVgagpol MLV кляп и Поль кодирования плазмиды 300 нг pTG Люк передачу вектор с Люцифераза репортер 400 нг pcDNA ТОРС-S, pcDNA РВК-S или пустой вектор 300 нг Сокращение сыворотке клетки культуры среднего До 50 мкл Таблица 1: количество плазмидов и сокращение сыворотке ячейки питательной среды, необходимые для transfect одной скважиной 6-ну плиты ГЭС 293T/17 клеток для производства pseudotyped частица. От концентрации препаратов плазмида рассчитайте необходимый объем для достижения необходимого количества плазмидной ДНК. Если более чем одна скважина является transfected с же плазмид, умножьте томов на необходимое количество лунок для transfect и включают в себя дополнительные скважины в расчеты, чтобы избежать исчерпания смеси в последующих шагах. Общее количество ДНК transfected-1 мкг/хорошо. Плазмиды предоставляются по запросу для авторов. Реагент Количество Трансфекция реагент 3 МКЛ Сокращение сыворотке клетки культуры среднего 47 МКЛ Таблица 2: количество трансфекции реагента и сокращение сыворотке ячейки питательной среды, необходимые для transfect одной скважиной 6-ну плиты ГЭС 293T/17 клеток для производства pseudotyped частиц. Умножьте томов на необходимое количество лунок для transfect и включить дополнительные скважины в расчеты, чтобы избежать исчерпания смеси в последующих шагах. Трансфекция реагента: плазмида ДНК используется показатель 3:1. Рисунок 1 : Коронавирус S-pseudotyped частиц инфективности анализов в восприимчивых принимающей ячейки с помощью мышиных лейкемии Вирус (МЛВ) позвоночника и Люцифераза Репортер ген. (A) ТОРС-CoV S pseudotyped частиц инфективности пробирного в клетках Vero-E6. (B) РВК-CoV S pseudotyped частиц инфективности пробирного в клетках ха-7. Для обоих (A) и (B), печатаемых данных соответствует средняя относительная Люцифераза единиц от трех независимых экспериментов, с погрешностей, соответствующее стандартное отклонение (с.д.). Данные отображены в журнал10 шкалы на оси y. Н.и.: неинфицированных управления; Δenv: инфекции с pseudotyped частицами не хватает гликопротеинов вирусный конверт и VSV-Gpp: инфекции с pseudotyped частицами, учитывая положительный контроль VSV G гликопротеина оболочки. Другие аббревиатура используется, ТОРС-Spp: инфекции с ТОРС-CoV S pseudotyped частицы, РВК-Spp: инфекции с РВК-CoV S pseudotyped частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Концентрация зависимость инфективности CoV S-pseudovirion и роль рецепторов ACE2 и DPP4 в запись ТОРС-Spp и РВК-Spp. (A) концентрация зависимость ТОРС-Spp и РВК-Spp инфекционности измеряется Люцифераза деятельности пробирного. Pseudovirions серийно были разбавленный и используется для заражения клеток Веро-E6. (B) инфективности transfected ТОРС-Spp и РВК-СПП в плохо разрешительной ГЭС 293T клеток-мишеней для Экспресс ACE2 и DPP4 рецепторов, соответственно. Данные диаграмме в журнал10 шкалы на оси y как показано на рисунке 1 из повторяющихся экспериментов, с погрешностей, соответствующее стандартное отклонение (с.д.). Н.Т.: не transfected управления ГЭС 293T клетки; ACE2: ангиотензин-превращающего фермента 2 (атипичной пневмонии-CoV рецептор) и DPP4: dipeptidyl пептидаза 4 (РВК-CoV рецептор). Другие сокращения, используемые такие же, как на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол описывает метод для эффективного производства pseudotyped частицы, с учетом белка S риска Группа 3 коронавирус, ТОРС-CoV и РВК-CoV, в обстановке BSL-2. Эти частицы, которые включают Люцифераза Репортер ген, позволяют нам легко количественно коронавирус S-опосредованной запись событий по сравнительно простой Люцифераза пробирного48,49,50,51. В инфективности анализов с использованием разрешительной клеток мы подтверждаем, что Люцифераза активности измеряется зависит от концентрации частиц. Кроме того ACE2 и DPP4 рецептор трансфекции позволяет эффективнее запись в плохо разрешительной клеточных линий, таких как ГЭС 293T клетки. Этот метод хорошо адаптируется к других вирусных конверт гликопротеинов и широко используется,48,49,50,51,52,53 55,56,,5758,59, часто для того, чтобы дополнять другие анализы как биохимические анализы или родной вирусных инфекций.

Протокол, мы описали здесь основан на ретровируса MLV, который включает Люцифераза репортер. Однако важно подчеркнуть, что существует весьма широкий спектр других pseudotyping систем, которые были успешно разработаны для упаковки коронавирус S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 и других вирусных конверт гликопротеинов10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. Некоторые из этих других систем основаны на часто используемые MLV ретровирусной ядро7,8,9,10,11,12,13 ,14,,1516,,1718,19,20, или на основе широко используемых лентивирусные ВИЧ-1 pseudotyping системы, используя различные стратегии23,24,25,26,27,28,29,30 ,,3132,33,34,35, или с rhabdovirus вирусом везикулярного стоматита (ВСВ) как ядро, которое позволяет включать широкий конверт гликопротеинов и снова с различными стратегиями занято37,,3839,40,,4142,43 ,–44,–45,–46,–47. Кроме того другие репортеры такие как флуоресцентные белки как GFP11,13 и ППП36или ферменты помимо Люцифераза как β-галактозидазы16,17 и выделяется щелочная фосфатаза (СЕАП)42 успешно применялись для измерений. Кроме того в assay, представленные в настоящем Протоколе, переходных transfection был использован выразить MLV и CoV S генов и белков. Однако есть другие стратегии для выражения, например создание стабильных клеточных линий для производства pseudotyped вирусов7,14. Поскольку каждая из этих систем имеют свои преимущества и недостатки, важно учитывать следующие важные параметры при принятии решения, какой лучший системы pseudotyping потребностям следователя: pseudovirion ядра (MLV, ВИЧ-1, виллах или другие), как селективный особое pseudotyping лежит в включения конкретных вирусный конверт гликопротеин, репортер пробирного индикация (GFP, Люцифераза, ППОС или другой) и трансфекции стратегии (количество плазмидов, участвующих в совместно трансфекции, переходные Трансфекция или поколения стабильных клеточных линий).

Существует ряд важных шагов в методе, которые важно подчеркнуть. Плотность клеток, особенно по линии клетки продюсер ГЭС 293T/17 является решающим фактором в обеспечении успешного transfection. Было установлено, что плотность ячеек в диапазоне 40 – 60% confluency быть оптимальным. Более высокой плотности обычно приводят к низкой трансфекции эффективность и низкий частиц производства. Кроме того важно иметь в виду, что ГЭС 293T/17 клетки являются менее адэрентных чем других клеточных линий. Следует проявлять осторожность при обработке их во избежание отсоединения их излишне. Одним из вариантов является для лечения клетки культуры пластиковых поверхностей с поли D-Лизин для повышения соблюдения. Кроме того выше ячейки проход часто приводит к плохой трансфекции ставок. После добавления реагента transfection клетки ГЭС 293T/17, важно также помнить, что увеличивает проницаемость клеток. Именно в этот момент лучше всего избегать использования средних содержащих антибиотики, как они могут увеличить цитотоксичности. Прежде чем собирать pseudotyped частицы, проверьте цвет transfected supernatants клетки ГЭС 293T/17. Как правило после 48 ч трансфекции, цвет ячейки питательной среды занимает оранжево розовый оттенок. Желтый цвет среднего обычно переводится как бедных pseudotyped частицы урожайности и часто является результатом проблем с посева плотность или высокий проход номер ячейки.

В этом протоколе производство pseudotyped частиц осуществляется в формате 6-ну пластины. Для увеличения объема производства частиц, несколько скважин 6-ну плиты можно transfected смесью же плазмидов и supernatants могут быть объединены вместе. Бассейн может быть уточнено, отфильтрованные и aliquoted. Кроме того для расширения производства вверх, другие виды судов (например, 25 или 75 см2 фляги) может использоваться. В этом случае условия transfection должен быть масштабируется соответственно. В настоящем Протоколе инфективности генотипирования с помощью формат 24-ну пластины и Люминометр, что позволяет только измерения одной трубы одновременно. Для фильмов высокой пропускной способности другие форматы также возможны, как формат 96-луночных пластины и Люминометр читателя пластины. Тома и реагенты для assay Люцифераза необходимо адаптировать соответствующим образом. Pseudotyped частиц в криопробирки-80 ° c для хранения сохраняет их стабильность в течение нескольких месяцев без заметное снижение инфекционности. Не рекомендуется подвергать их замораживания оттаивания циклов, как это будет уменьшаться с течением времени их инфективности. Таким образом, лучше хранить их в небольших аликвоты например 0,5 – 1 мл и размораживать их перед инфекцией.

Представленные здесь метод имеет некоторые ограничения. Важным является тот факт, что pseudotyped частицы резюмировать только вирусные записи события. Чтобы проанализировать другие шаги в жизненном цикле инфекционные, требуются другие анализы. Кроме того как MLV частицы бутон на плазматической мембраны, важно иметь в виду, что конверт гликопротеин, изучаются потребности также движением к плазматической мембраны для включения в pseudovirions в процессе производства. Таким образом важно знать, где в ячейке конкретного вирусного конверт гликопротеин выражается в трансфекции условий, такие как визуализация субцеллюлярные локализации с помощью иммунофлуоресцентного анализа, и/или проверка для сохранения сигналов в течение белка. Кроме того в то время как протокол описывает шаги для создания и тестирования инфективности, он не подробно, как измерить включению вирусных конверт гликопротеинов pseudotyped частиц. Один метод — выполнить иммуноблоттинга анализов на концентрированные растворы частиц, как описано в50,51 для включения РВК-CoV S. В этих анализов S конверт гликопротеина об РВК-CoV является зондируемой наряду с капсид (p30) белка MLV, которые позволяют нам нормализовать белка S включения частиц. Другие примеры таких анализов, анализа вирусной конверт гликопротеина включения в pseudovirions были выполнены для включения ТОРС-CoV S в ВИЧ-1 лентивирусные pseudovirion системы32 , Эбола гликопротеина (GP) в другой MLV pseudotyped системы частиц17и гриппа гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) в виллах pseudovirions38. Последние развития в характеризующих производство pseudotyped частиц является использование инновационных тепловизионных устройств, таких как Nanosight: он позволяет нам непосредственно визуализировать, количественно и размер вирусных частиц50. Устройство предоставляет подробную информацию о целом частиц производства; Однако важно иметь в виду, что он не представить информацию о включении гликопротеина оболочки. Будущее направление для применения этих универсальных pseudovirion частиц является анализ отдельных вирусный фьюжн событий с помощью одной частицы отслеживания, микрофлюидика и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии60,61 ,62. Такие подходы были успешно применены к вируса гриппа и кошачьих коронавирус частиц, а также гриппа ха – и NA-pseudotyped на базе VSV pseudovirions63. Развертывание таких методов применяется к коронавирус S-pseudotyped на основе MLV частиц в настоящее время разрабатывается.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить всех членов Уиттакер и Даниэль labs за полезные замечания. Исследования финансировались НИЗ предоставляет R21 AI111085 и R01 AI135270. Т.т. признает поддержку от президентских стипендий науки о жизни в Корнелльском университете и национального научного фонда выпускников исследовательских стипендий программа под Грант № DGE-1650441. Л.н. отмечает поддержку от Samuel C. Флеминг семьи стипендий и национального научного фонда выпускников исследовательских стипендий программа под № Грант DGE-1650441. Эта работа также поддерживается национальной науки фонд 1504846 (чтобы с.д. и G.R.W.).

Materials

Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77 (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4 (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202, 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300 (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261 (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326 (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78 (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75 (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78 (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55 (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88 (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -. C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225 (2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393 (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321 (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166 (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305 (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87 (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85 (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84 (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206 (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446 (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436 (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161 (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59 (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84 (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88 (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10 (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34 (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169 (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5 (12), 126 (2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88 (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6 (23), 2035 (2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2′ region. Journal of General Virology. , (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83 (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393 (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -. Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34 (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -. Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29 (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -. L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537 (2016).

Tags

Pseudotyped ParticlesCoronavirusViral EntryBiosafety Level 2HEK293T CellsTransfectionPlasmid CotransfectionCell CultureCell DensityCell Morphology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image