在生物安全2级环境中制备假型颗粒研究高致病性冠状病毒

1. 用于假型颗粒生产的细胞播种 请注意:在生物安全柜中执行此步骤。 通过标准的细胞培养技术, 获得一个80–90% 融合75厘米2气瓶的 hek-293t17 细胞通过完整的 dulbecco 的修饰鹰的培养基 (dmem-c), 其中含有 10% (volvol) 胎牛血清 (fbs), 10 mm 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪磺酸 (hepes)、100 uu/ml 青霉素和100μgml 链霉素。准备 DMEM-T 介质进行转染 (其成分与 DMEM-T 相同, 但不含抗生素)。 用10毫升的预加热 (37°c) 杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水 (dpbs) 清洗细胞两次。请注意:小心地处理 hek29t17 细胞, 因为它们很容易分离。 在37°c 预热时, 用1毫升0.25% 的胰蛋白酶溶液吸收上清液和分离细胞。将细胞的烧瓶放在 37°c, 5% co 2 孵化器 3-5分钟或直到细胞开始分离。请注意:避免用胰蛋白酶孵育细胞超过 5分钟, 因为这通常会导致细胞聚集。 通过添加4毫升的 dmem-c 培养基和计数细胞来停用胰蛋白酶, 并使用细胞计数幻灯片和光学显微镜。请注意:为了避免需要计数过多的细胞, 可能需要事先采取额外的稀释步骤。在计算胰蛋白酶化细胞的实际细胞密度时, 请记住考虑到这种稀释。 用 dmem-c 将细胞稀释至 5x 10 5细胞。 种子6孔组织培养板与2毫升的细胞溶液每口井, 并轻轻地来回和侧向移动板均匀分布细胞, 避免圆周运动。请注意:这是关键的一步。均匀分布的细胞将确保细胞不会聚集在井的中心。反过来, 这将确保良好的转染效率和伪型颗粒生产。 在37°c、5% co2细胞培养孵化器中孵育板 (16–18小时)。 2. 三粒质粒共转染 请注意:在生物安全柜中执行此步骤。 在倒置光学显微镜下观察细胞, 以检查细胞的形态和密度。请注意:理想情况下, 细胞密度应在40–60% 的融合范围内。至关重要的是, 细胞既不是太汇出 (80-90% 融合), 也不是太稀疏分布 (20-30% 融合) 在每口井。细胞密度为40-60% 的融合将确保良好的伪型颗粒的产生。 质粒混合 根据表 1所示6井板的一口井的数量, 计算每个包络糖蛋白的质粒混合物。如果转染几口井, 并包括一口额外的井, 以避免混合耗尽, 则会增加数量。请注意:除了 sars-cov s 和 mers-cov s 编码质粒外, 还包括空矢量控制, 用于产生缺乏病毒包膜糖蛋白 (env 粒子) 的负控制粒子, 以及一个正对照糖蛋白, 如囊泡口腔炎病毒 (vsv) g 糖蛋白, 已知能有力地感染非常广泛的细胞 (vsv-gpp)。可应要求提供质粒。 将计算出的质粒体积和减少的血清细胞培养培养基 (见材料表) 混合在微离心管中。 基于脂质的转染试剂混合物(见材料表) 根据表 2所示的一口井的数量计算转染试剂混合物的体积 (1:3 转染比, 根据需要乘以数量)。包括额外的井, 以避免耗尽转染试剂的混合物。 将计算出的脂基转染试剂 (每口3毫升) 和减少的血清细胞培养培养基 (每井 47μl) 混合在微离心管中, 确保将转染试剂添加到减少的血清细胞培养培养基中, 而不是以其他方式添加转染试剂周围。 在室温下分别将两种混合物 (一口井: 50μl 的质粒混合物和50μl 的脂质转染试剂混合物) 培养5分钟。 将转染试剂混合物的内容添加到质粒中, 比例为 1:1 (每种混合物为1口井: 50μl) 对产生的混合物进行彻底的上下移液。 在室温下将混合物孵化至少20分钟。 吸收细胞的乏培养基。 轻轻加入1毫升预热 (37°c) 减少血清细胞培养培养基。 在每口井中加入滴度100μl 转染混合物。请注意:当 hek-293t 井容易分离时, 在将转染混合物添加到井时要小心。 将细胞孵育在 37°c, 5% co2 细胞培养孵化器中, 孵育4-6小时。 在不含抗生素的预热 (37°c) dmm-t 培养基中, 每口井添加1毫升请注意:这是关键的一步。转染试剂可提高细胞通透性, 提高对抗生素的敏感性。为保证良好的转染效率和伪型颗粒的产生, 避免使用含有抗生素的细胞培养基是非常重要的 在 37°c, 5% co2 细胞培养孵化器中孵育细胞48小时。 3. 伪分型颗粒集合 请注意:在生物安全柜中执行此步骤。 观察倒置光镜下的细胞形态和一般情况。还要检查介质的颜色, 这些介质应该是浅的粉红/略带橙色。请注意:这是一个重要的步骤。如果有太多的细胞死亡与转染或中等颜色变成橙色黄色 (酸性 ph), 这通常会与较低的传染性假型颗粒的产量 将转染细胞的上清液转移到50毫升锥形离心管中。 以 290 x g 离心管 7分钟 , 清除细胞碎片。 滤清器通过0.45μm 孔径的无菌过滤器澄清上清液。 在低温中制造小体积的伪型病毒溶液 (例如, 500μl 或 1 ml)。 存放在-80°c。请注意:协议可以在这里暂停。假型颗粒在-80°c 下稳定数月, 但解冻后, 避免重新冻结, 因为它们会失去传染性 4. 易感细胞的假型颗粒感染 请注意:在生物安全柜中执行此步骤。 24孔板易感细胞的细胞播种 通过标准细胞培养技术获得80-90% 的75厘米2易感细胞的融合: sars-cov 伪型粒子 (sars-spp) 的 vero-e6 细胞和中东呼吸综合征 cov s 伪型粒子 (mers-spp) 的 huh-7 细胞。请注意:为了确认所产生的伪型粒子是否具有传染性, 重要的是要仔细选择合适的易感细胞系进行伪病毒感染检测。使用许可性差的细胞会导致低传染性。 用预热 (37°c) dpbs 的10毫升清洗细胞两次。 在37°c 预热时, 用1毫升0.25% 的胰蛋白酶溶液吸收上清液和分离细胞。将细胞的烧瓶放在 37°c, 5% co 2 孵化器 3-5分钟或直到细胞开始分离。请注意:避免用胰蛋白酶孵育细胞超过 5分钟, 因为这通常会导致细胞聚集。huh-7 细胞对这种效应特别敏感。 通过添加 dmem-c 培养基和使用细胞计数幻灯片和光学显微镜计数细胞来停用胰蛋白酶。 用 dmem-c 将细胞稀释至 5x 10 5细胞。 24孔板的种子井, 每口井有0.5 毫升的细胞溶液, 并轻轻来回和侧向移动板均匀分布细胞, 避免圆周运动请注意:这是关键的一步。均匀分布的细胞将确保细胞不会聚集在井的中心。反过来, 这将确保良好的传染性检测。对于每个伪类型粒子 (sars-spp, mers-spp) 和条件, 为三个实验复制准备三口井。包括未受感染的井 (n. i.)、空向量 env 粒子和正对照粒子, 如 vsv-gpp 在37°c、5% co2细胞培养孵化器中孵育板 (16-18小时) 伪型粒子感染 在光学显微镜下观察细胞, 并在视觉上证实有一个混合地毯的细胞。 将伪型病毒的冷冻剂带到冰上解冻。 用 0.5 ml 预热 (37°c) dpbs 清洗细胞三次请注意:这是关键的一步。在感染前没有适当冲洗的细胞通常会导致不良的传染性读数 吸收细胞的上清液。 具有200μl 解冻的伪型颗粒溶液的接种细胞。 在37°c、5% co2细胞培养孵化器中孵育细胞1-2小时。 加入300μl 的预热 (37°c) dmem-c 介质。 在37°c、5% co2细胞培养孵化器中孵育细胞72小时。 5. 通过荧光素酶检测读数进行的传染性定量 请注意:在生物安全柜中执行初始步骤。 解冻荧光素底物 (储存在-80°c) 和5倍荧光素酶裂解缓冲液 (储存在-20°c), 直到达到室温。 用无菌水稀释荧光素酶分析裂解缓冲液1x。 吸收假型颗粒感染的细胞的吸血上清液。 在每口井中加入100μl 的1x 荧光素酶分析裂解缓冲液。 将板材放在摇杆上, 在室温下摇椅孵育 15分钟 (从此时开始, 板材可在生物安全柜外处理)。 在每口井中加入20μl 的荧光素基板, 为每口井准备微离心管。 打开计时器。 通过将10μl 的裂解液转移到一个含有20μl 的荧光素基质的管中, 一次很好地测量一个荧光素酶活性。 轻轻滑动管, 混合内装物, 但避免更换管壁上的液体。 将管子放入设备并合上盖子。 使用电光计测量管的发光值。 记录相对光单位的测量值。 重复步骤 5.8–5.12, 直到对所有油井进行分析。请注意:有了相应的设备, 如制版读数计, 这个过程可以自动执行。检测将需要缩放到板格式 (例如, 96 孔板格式)。 6. 数据分析 相对荧光素酶单位平均值和标准偏差的计算与绘制 使用图形绘图软件计算荧光素酶测定平均值和标准偏差的实验和生物复制。 将数据绘制为带有标准偏差的条形图。请注意:在对数据进行统计分析时, 请确保在数据集中至少包括三个生物复制。