Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

Les preuves expérimentales et cliniques montrent que les cellules hématopoïétiques peut améliorer modérément la performance contractile du ventricule gauche n’a pas de coeurs^{1,2,3,4,5 ,6,7,8,9}. Les progrès récents ont ouvert davantage attrayant de possibilités pour la regénération cardiovasculaire ; citons l’expression forcée des facteurs de reprogrammation de cellules somatiques pour induire la pluripotence et différencier ces des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en différentes lignées cardiaques, ce qui est important cardiomyocyte (CM)^{10, 11 , 12 , 13}. le matériel héréditaire dans chaque cellule, y compris le CISP artificiellement généré et dérivés iPSC CM (iPS-CM), est l’ADN. Les instructions génétiques stockées dans ADN dicte la croissance, le développement et la fonction des cellules, tissus, organes et organismes. L’ADN n’est pas inerte ; métabolites, comme réactives de l’oxygène carbonyle et azotés, de cellules et des agents alkylants ADN cause endommager in vitro et in vivo^14,15,16,17. Ce qui est important, les dommages à l’ADN se produisent intuitivement dans chaque cellule, avec une fréquence significative. Si ces dommages ne sont pas corrigées, il conduira à la mutation de l’ADN, la sénescence cellulaire, la perte d’intégrité de l’ADN et de cellules et éventuellement, des maladies, y compris les cancers mortels. Conserver l’intégrité de l’ADN est donc essentielle pour n’importe quelle cellule, en particulier la CISP, qui a un potentiel énorme dans la clinique.

Pour évaluer la quantité et l’intégrité de l’ADN génomique isolé, un matériel onéreux est disponible sur le marché. Cependant, il n’y a aucune méthode simple et économique pour évaluer l’intégrité de l’ADN dans les cellules sans isoler les cellules. En outre, dégradation de l’ADN induite par l’utilisateur lors de l’isolation de l’ADN est l’un des inconvénients majeurs dans l’utilisation de ces méthodes. Les unicellulaires gel électrophorèse (connu comme le test des comètes)^18,19 et γH2A.X immunomarquage⁸ techniques sont des approches fondamentales dans les laboratoires de recherche pour évaluer les dommages à l’ADN. Ces deux méthodes ne nécessitent pas de matériel coûteux ou ADN génomique isolé pour analyser l’ADN intégrité^8,20,21. Depuis, ces techniques ont été réalisées avec des cellules entières ; dégradation de l’ADN/ARN/protéines induite par l’utilisateur lors de la préparation de l’échantillon n’affectera pas ces protocoles. Ici, pour évaluer les dommages à l’ADN et la réponse aux dommages de l’ADN dans les souches et les cellules de tige-cellule-dérivé, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer les deux la comète dosage et γH2A.X immunomarquage. En outre, combinant ces deux approches, nous vous proposons une évaluation naïve qui peut être utilisée pour évaluer les qualités de la cellule à la transplantation.

Le test des comètes ou unicellulaires électrophorèse sur gel, mesure les cassures de l’ADN dans les cellules. Incorporé dans l’agarose à bas point de fusion des cellules sont lysées à nucléoïdes formulaire contenant de l’ADN surenroulé. Lors de l’électrophorèse, petits morceaux de fragments d’ADN et des brins d’ADN cassés migre à travers les pores du gel d’agarose, alors que l’ADN intact, en raison de leur taille énorme et leur conjugaison avec la protéine de la matrice, aura une migration restreinte. Le modèle de l’ADN tachée sous un microscope à fluorescence imite une comète. La tête de la comète contient l’ADN intact et la queue est composée de fragments et cassée brins d’ADN. La fraction des dommages à l’ADN peut être mesurée par l’intensité de la fluorescence de l’ADN endommagé (queue de comète) par rapport à l’intensité de (tête de la comète) ADN intacte. Le moment de queue de paramètre peut être calculé comme indiqué à la Figure 1.

Dommages à l’ADN induit la phosphorylation de l’histone H2A. X (γH2A.X) sur le Ser139 par les kinases ATM, ATR et ADN-PK. La phosphorylation et le recrutement de H2A. X à ruptures de brins d’ADN est appelée réponse aux dommages de l’ADN (DDR) et arrive rapidement après que l’ADN est endommagé. Suite à ce processus, l’arrestation d’induite par le point de contrôle de cycle de cellules et l’ADN, processus de réparation sont initiées. Après l’achèvement de la réparation de l’ADN, γH2A.X est déphosphorylée et inactivé par les phosphatases. Prolongée et plusieurs brins d’ADN conduisent à l’accumulation de foyers γH2A.X dans l’ADN. Cela indique l’incapacité de la cellule pour réparer les lésions de l’ADN et la perte d’intégrité de l’ADN. Ces foyers γH2A.X dans l’ADN peuvent être identifiés par et le nombre de foyers DDR peut être compté en utilisant le protocole à l’article 2.