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Neurowissenschaften

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Published: January 29, 2019
doi:
10.3791/58960
, , , ,
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience,KU Leuven, 3Leuven Brain Institute

Summary

Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all’utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un’elevata purezza, pronta per l’uso in vitro o in vivo .

Abstract

Gene consegna strumenti basati su virus adeno-associato (AAVs) sono una scelta popolare per la consegna dei transgeni al sistema nervoso centrale (CNS), tra cui applicazioni di terapia genica. I vettori AAV sono non replicare, in grado di infettare le cellule di divisione e divisione e fornire a lungo termine espressione del transgene. Cosa importante, alcuni sierotipi, ad esempio il PHP recentemente descritto. B, può attraversare la sangue-cervello-barriera (BBB) nei modelli animali, seguendo la consegna sistematica. Vettori di AAV possono essere prodotto in modo efficiente in laboratorio. Tuttavia, protocolli affidabili e riproducibili sono necessari per ottenere vettori AAV con sufficienti livelli di purezza e i valori del titolo abbastanza alti per applicazioni in vivo . Questo protocollo descrive una strategia efficiente e riproducibile per la produzione di vettore AAV, basata su una strategia di purificazione gradiente di iodixanol. Il metodo di purificazione di iodixanol è adatto per ottenere lotti di vettori AAV alto-titolo di elevata purezza, quando rispetto ad altri metodi di purificazione. Inoltre, il protocollo è in genere più veloce rispetto ad altri metodi attualmente descritti. Inoltre, una polimerasi quantitativa (qPCR) di reazione a catena-strategia di base è descritto per una determinazione rapida e accurata del titolo di vettore, come pure un argento che macchia il metodo determinare la purezza del batch vettoriale. Infine, i risultati rappresentativi di consegna del gene al SNC, dopo somministrazione di AAV-PHP. B, sono presentati. Tali risultati dovrebbero essere possibile in tutti i laboratori utilizzando i protocolli descritti in questo articolo.

Introduction

Negli ultimi 30 anni, il selvaggio-tipo adenoassociati sono stati progettati per creare vettori AAV ricombinanti, che hanno dimostrato di essere eccezionalmente utili strumenti per il trasferimento genico nei CNS1,2,3,4, 5,6 e la terapia genica si avvicina a malattia (comprese le terapie approvate da FDA ed EMA)4,7. Loro idoneità all’uso nello SNC deriva in gran parte dalla loro capacità di infettare le cellule post-mitotiche, divisione, in genere trovato nel CNS8. Tuttavia, vettori AAV-based hanno anche il vantaggio di permettere un’espressione a lungo termine di qualsiasi determinato transgene terapeutico4,9 mentre indurre una risposta immunitaria più mite rispetto ad altri vettori virali7, 8,10,11,12.

Gli elementi principali di qualsiasi vettore AAV sono il genoma e le proteine del capside. Selvaggio-tipo adenoassociati sono singolo filamento (ss) virus a DNA con un genoma di circa 5 kilobasi (kb)13. Per la produzione di vettori AAV ricombinanti, i geni rep e cap (necessari per la replica di genoma e l’assemblaggio del capside virale) vengono eliminati dal genoma di AAV il selvaggio-tipo e forniti in trans, lasciando spazio per un Cassetta di espressione contenente il transgene14,15. Le sequenze ripetizione terminale invertite (ITRs) del genoma virale originale sono gli unici elementi conservati in un vettore AAV, come questi sono essenziali per la replica e imballaggio3,10,14. Vettori di AAV possono essere progettati per migliorare l’espressione del transgene; una mutazione in uno dei ITRs conduce alla formazione di un ciclo di tornante efficacemente consente la generazione di un complementare DNA strand3,7,15. Il principale vantaggio di questa configurazione, definito un genoma di self-complementari (sc), è che ignora la necessità di sintesi secondo-filo tipica del ciclo convenzionale di AAVs, aumentando considerevolmente la velocità e i livelli di espressione del transgene 1. Tuttavia, l’utilizzo di un genoma di scAAV riduce la capacità di carico del vettore di circa 2,4 kb. Questo include sequenze di transgene, nonché eventuali sequenze regolatrici come promotori o siti di legame per microRNA, per limitare l’espressione a cella specifica tipi16.

Le proteine del capside AAV determina l’interazione tra cellula di vettore-ospite e conferisce un grado di tropismo di tessuto o tipo di cella per un sierotipo AAV, che può essere sfruttato anche per limitare l’espressione del transgene in posizioni specifiche. Diversi sierotipi AAV si trovano in natura, mentre gli altri sono stati prodotti nei laboratori attraverso approcci ricombinanti (cioè, PHP. B). Inoltre, alcuni capsidi conferiscono anche altre caratteristiche utili, quali la capacità di attraversare la BBB, conseguente la consegna di transgeni in tutto il sistema nervoso centrale dopo somministrazione sistemica. Ciò è stato dimostrato per AAV9, così come per il PHP recentemente descritto. B capside17. Di conseguenza, questi sierotipi stanno dimostrando di essere particolarmente rilevante per nuovi approcci di terapia genica per i disordini di neurodegenerative1,17,18.

L’obiettivo di questo protocollo è di descrivere un metodo conveniente per la produzione su piccola scala di vettori AAV con alto titolo e purezza. Anche se i risultati presentati qui utilizzano il PHP. Capside di B e una cassetta di espressione scAAV, il protocollo è adatto per la produzione di diversi sierotipi di vettore AAV e configurazioni di genoma, permettendo la massima flessibilità sperimentale. Tuttavia, il vettore resa e purezza finale può variare secondo il sierotipo selezionato.

Il protocollo stesso è una variante del metodo classico tri-transfezione per la produzione di vettori virali e incorpora l’uso di un gradiente di iodixanol per vettore pulito-up, che, rispetto all’uso classico di gradienti di cesio cloruro (CsCl), è stato segnalato per produrre vettori AAV di purezza superiore a in un modo più efficienti in termini di tempo, il19,20,21.

I passaggi di transfezione, la purificazione e la concentrazione sono destinati a essere eseguiti secondo buona pratica di laboratorio (BPL) in un laboratorio di cultura del tessuto voto per il lavoro di vettore virale. Ogni attività deve essere eseguita in conformità con la legislazione locale e nazionale riguardante la produzione di vettori virali e utilizzare. Lavori devono essere eseguiti sotto cappa a flusso laminare e in condizioni di sterilità. All’interno della struttura di vettore, si raccomanda di indossare un grembiule di laboratorio, oltre al cappotto del laboratorio di coltura del tessuto normale. Inoltre, una doppia coppia di guanti, come pure Copriscarpe plastica, deve essere indossata in ogni momento.

Prima di iniziare la produzione di vettore, garantire tutte le attrezzature necessarie e plasmidi sono disponibili. 1) pCapsid plasmide contiene il gene rep che codifica quattro proteine non strutturali necessari per la replica, vale a dire Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 e il tappo gene che codifica per tre proteine strutturali del capside, vale a dire VP1, VP2 e VP3. 2) pHelper plasmide contiene i geni E4, E2Ae VA da adenovirus, che facilitano la produzione di AAV in HEK293T cellule. 3) pTransgene plasmide contiene la cassetta di espressione del transgene, affiancata da due ITRs. Questi plasmidi possono essere sintetizzati de novo in laboratorio utilizzando sequenze disponibili online22. Per plasmidi fatti de novo, soprattutto quelli contenenti romanzo transgeni, sequenziamento è necessario assicurarsi che il transgene e ITRs siano corretti. In alternativa, premade plasmidi possono essere acquistati direttamente attraverso il repository online plasmide. Quando necessario, plasmidi possono essere amplificati e purificati mediante kit standard, secondo istruzioni23 del produttore.

Titolo di vettore e purezza possono influenzare negativamente la capacità di trasduzione del vettore. Protocolli aggiuntivi sono forniti per valutare la qualità del prodotto vettore. I vettori finali sarà utili per gli studi della funzione cella CNS in applicazioni sia in vitro che in vivo .

Protocol

Soluzione Composizione Coltura cellulare e transfezione DMEM1 DMEM 1 x 1% FBS (v/v) 1% GlutaMAX (v/v) DMEM10 DMEM 1 x 10% FBS (v/v) 1% GlutaMAX (v/v) 150 mM NaCl 4,380 g NaCl Fino a 500 mL di acqua ultrapura AAV depurazione e dissalazione 5m NaCl 146,1 g NaCl Fino a 500 mL di acqua ultrapura 1 M Tris-HCl (pH 8.5) base di Tris 12,11 g ATTENZIONE Fino a 100 mL di acqua ultrapura Aggiungere 1 M HCl, utilizzando una pipetta di Pasteur per ridurre il pH a 8,5 Buffer di lisi 15 mL di NaCl 5 M 25 mL di 1 M Tris-HCl (pH 8.5) ATTENZIONE Fino a 500 mL di acqua ultrapura 10X tampone fosfato salino (PBS) 80 g di NaCl g 2 KCl ATTENZIONE 14,4 g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4 Fino a 1 L di acqua dd 1 M MgCl2 20,33 g MgCl2-6 H2O Fino a 100 mL di acqua ultrapura KCl 1m 7,45 g KCl ATTENZIONE Fino a 100 mL di acqua ultrapura 5 x soluzione PBS magnesio-potassio (PBS-MK) 250 mL di PBS 1x 10 2,5 mL di 1 M MgCl2 6,25 mL di KCl 1m ATTENZIONE Fino a 500 mL di H2O acqua Ultrapure 15% Iodixanol 12,5 mL di terreno gradiente di densità Optiprep ATTENZIONE 10 mL di NaCl 5 M 10 mL di 5 x PBS-MK 17,5 mL di acqua ultrapura 25% Iodixanol 20,8 mL di terreno gradiente di densità Optiprep ATTENZIONE 10 mL di 5 x PBS-MK 19,2 mL di acqua ultrapura 100 µ l di rosso fenolo 40% Iodixanol 33,3 mL di terreno gradiente di densità Optiprep ATTENZIONE 10 mL di 5 x PBS-MK 6,7 mL di acqua ultrapura 60% Iodixanol 50 mL di terreno gradiente di densità Optiprep ATTENZIONE 100 µ l di rosso fenolo ATTENZIONE Controllo della purezza dell’AAV 10X tampone Tris acetato EDTA (tè) base di 44,8 g Tris ATTENZIONE 11,4 mL di acido acetico glaciale (17.4M) 3,7 g EDTA Acqua ultrapura L fino a 1 Gel di agarosio 0,8 g agarosio ultrapura Fino a 100 mL di tampone di tè 1 x Buffer di gel base di Tris 181,7 g ATTENZIONE 1,5 g SDS ATTENZIONE Regolare il pH a 8,45 con 1M HCl ATTENZIONE Fino a 500 mL di acqua ultrapura Catodo tampone 10x base di Tris 121,14 g ATTENZIONE g 179,2 Tricine ATTENZIONE 1% SDS (w/w) ATTENZIONE Acqua ultrapura L fino a 1 Anodo del buffer 10x base di Tris 242,3 g ATTENZIONE Acqua ultrapura L fino a 1 Aggiustare il pH a 8,9 con 1M HCl ATTENZIONE Sample buffer 5x Per 20 mL: base di Tris 605 mg ATTENZIONE 4G SDS ATTENZIONE 10 mg Serva blu G 12 g di glicerolo Aggiustare il pH a 6,8 con 1M HCl, aliquotare e conservare a-20 ° C ATTENZIONE Gel d’impilamento Per 2 gel: Acrilammide 400 µ l ATTENZIONE 750 µ l di tampone di gel 1,85 mL acqua ultrapura 4 Μ L TEMED ATTENZIONE 20 µ l 10% APS (v/v) ATTENZIONE Aggiungere TEMED e 10% APS immediatamente prima di versare il gel. Utilizzare sia i prodotti chimici sotto una cappa chimica. Gel di risoluzione Per 2 gel: acrilammide 3,32 mL ATTENZIONE buffer di 3,35 mL gel 1,14 mL acqua ultrapura glicerolo al 50% mL 2,12 6 Μ L TEMED ATTENZIONE 50 µ l 10% APS (w/v) ATTENZIONE Aggiungere TEMED e 10% APS immediatamente prima di versare il gel. Utilizzare sia i prodotti chimici sotto una cappa chimica. Butanolo saturo d’acqua 10 mL di n-butanolo ATTENZIONE 1 mL di acqua ultrapura Attenzione: Fare riferimento alla tabella di materiali per le linee guida sull’uso di sostanze chimiche pericolose. Tabella 1: Composizione delle soluzioni necessarie. 1. Tri-transfezione delle cellule HEK293T Nota: Per la composizione del buffer e le soluzioni utilizzate nel protocollo, fare riferimento alla tabella 1 .Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo dura circa 4 giorni. Scongelare una fiala di cellule 293T cellule embrionali umane del rene (HEK) in un bagno di acqua a 37 ° C.Nota: Utilizzare solo le celle che sono state attraversate in meno di 20 x per garantire efficienza di trasfezione ottimale. Cellule di HEK293T seme ad una densità di 2 x 103 6 x 103 cellule/cm2 in DMEM10 in piastre di coltura cellulare diametro 15cm. Crescere le cellule a confluenza di 70 – 80% in un incubatore standard impostato a 37 ° C, con 95% umidità e 5% CO2.Nota: La produzione di un lotto di vettori AAV utilizzando questo protocollo richiede 18 piastre di coltura delle cellule (15 cm di diametro). Una confluenza di cella di 70-80% corrisponde a 6 x 103 a 7 x 103 cellule/cm2, mantenuto in 17 – 20 mL di terreno di coltura di DMEM10. Preparare polyethylenimine (PEI) / DNA mix ad un rapporto di concentrazione di 1/3.5 (w/w). Preparare il mix di DNA per 18 piastre di coltura di cellule in una provetta conica da 50 mL con 360 µ g di 180 µ g di pTransgene in 18 mL di NaCl 150 mM, 180 µ g di pCapsid e pΔF6. Distribuire la miscela di DNA tramite tre provette coniche da 50 mL (6 mL di DNA mescolare a tubo conico). Preparare la miscela di PEI per sei delle cellule piastre di coltura in una nuova provetta conica 50 mL di miscelazione 840 µ g di PEI (1 µ g / µ l) in 6 mL di NaCl 150 mM. Preparare la miscela di PEI/DNA aggiungendo 6 mL della miscela PEI (preparata al punto 1.4.3), goccia a goccia, a uno dei tubi conici contenenti il mix di DNA (preparato al punto 1.4.2) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.Nota: Dopo 20 minuti di incubazione, la miscela di PEI/DNA diventerà leggermente torbida. Prendere sei piastre di coltura delle cellule fuori dell’incubatrice ed aspirare completamente il mezzo da ogni piatto di cultura in una cappa a flusso laminare. Rimuovere le tracce del mezzo lavando i piatti con 5 mL di soluzione tampone fosfato di preriscaldati Dulbecco (DPBS). Garantire la distribuzione di DPBS su tutta la superficie inclinando leggermente il piatto. Delicatamente aspirare il DPBS e aggiungere 12 mL di DMEM1 ad ogni piatto.Nota: Evitare di staccare le cellule aggiungendo lentamente, il mezzo da una pipetta collocata al bordo del piatto. Mescolare il PEI/DNA pipettando su e giù per 3x – 5x. Aggiungere 2 mL della miscela PEI/DNA per ciascuno dei sei celle cultura piatti in modo goccia a goccia, distribuendola accuratamente su tutta la superficie. Una volta che la miscela viene aggiunto a ogni piatto, posizionare i piatti indietro nell’incubatore. Ripetere i passaggi 1.4.3– 1.8 per i restanti piatti di cultura. Incubare le cellule trasfettate per 5 h a 37 ° C, con umidità 95% e 5% CO2. Aggiungere un ulteriore 12 mL di DMEM10 ad ogni piatto di cultura senza rimuovere il supporto pre-esistente (volume medio totale = 25 mL). Incubare le cellule trasfettate alto per la post-transfezione 72 h a 37 ° C, con 95% umidità e 5% CO2. Complementare figura 1: morfologia delle cellule HEK 293T visualizzata da microscopia di contrasto fase (a sinistra), con conferma di espressione di GFP visualizzata tramite fluorescenza imaging (a destra). (A) riuscita transfezione delle cellule HEK293T con un pTransgene di GFP-codifica è confermata da formazione immagine di fluorescenza. (B) HEK293T cellule trattate esclusivamente con reagenti di transfezione non mostrano alcuna espressione di GFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Raccogliere il mezzo e la post-transfezione di 72h di cellule. Utilizzare un raschietto di cella per scollegare attentamente le cellule dalla piastra di coltura. Raccogliere il mezzo e le cellule in una provetta conica da 50 mL tenuta su ghiaccio.Nota: Il contenuto di due piastre di coltura delle cellule possa essere raccolti in una provetta conica singolo 50 mL. Alla fine di questo passaggio, ciascuna delle nove provette conterrà circa 50 mL di terreno. Centrifugare le provette coniche a 420 x g per 10 min a 4 ° C con l’accelerazione e la decelerazione della centrifuga impostata al massimo. Attentamente e scartare il surnatante da ciascuna provetta. Non usare pipette per prevenire la perdita di materiale. Invece, delicatamente versare il surnatante in un contenitore di smaltimento dei rifiuti e posizionare le provette contenenti il pellet cellulare torna sul ghiaccio. Risospendere ogni cellulare in 2 mL di tampone di Lisi direttamente nella provetta conica 50 mL pipettando su e giù per 5 – 10 volte. Non centrifugare. Piscina i lisati da tre tubi insieme.Nota: A questo punto, ci saranno tre provette coniche da 50 mL, contenenti ciascuna una mL 6 delle cellule del sedimento in tampone di lisi. 2. purificazione di vettore AAV Nota: Le prestazioni di questa sezione protocollo prende circa 1 giorno. Eseguire le seguenti operazioni simultaneamente su ogni le tre provette coniche da 50 mL contenente le cellule risospese in tampone di lisi (vedere nota precedente). Congelare e scongelare le cellule sedimento 3 x per lisare loro e rilasciare le particelle AAV. Eseguire il passaggio di congelamento inserendo i tubi in un secchio contenente ghiaccio secco mescolato con etanolo. Eseguire lo scongelamento mettendo immediatamente le cellule in un bagno di acqua a 37 ° C. Dopo la terza fase di scongelamento, centrifugare a 1.167 x g per 15 min a 4 ° C.Nota: Si formerà un evidente pellet composto da detriti cellulari. Quando si maneggiano i tubi, evitare movimenti bruschi come questi possono causare il distacco del pellet nel surnatante, che comprometterà la purezza del vettore finale. Trasferire con cautela i surnatanti per pulire provette coniche da 50 mL e quindi aggiungere nucleasi a ciascuna provetta, ad una concentrazione finale di 50 U/mL di surnatante. Incubare per 30 min a 37 ° C. Agitare le provette coniche da 50 mL a mano ogni 10 min per garantire che le nucleasi è ben amalgamata con il surnatante. Chiarire il surnatante mediante centrifugazione a 13.490 x g per 20 min a 4 ° C. Montare un filtro da 0,45 µm una siringa da 10 mL e posizionarlo sopra un tubo conico pulito 50 mL. Rimuovere lo stantuffo con cautela e riempire la siringa con il surnatante da passo 2.5. Usare lo stantuffo per forzare il lisato attraverso il filtro. Utilizzare un nuovo filtro e la siringa per ogni tubo del surnatante ottenuto nel passaggio 2.5.Nota: La frazione ottenuta è nota come ‘greggio lisato’. Preparare ciascuna delle frazioni iodixanol 15%, 25%, 40% e 60% in quattro provette coniche da 50ml separati, secondo le istruzioni riportate nella tabella 1. Preparare le pendenze di iodixanol in tre tubi di ultracentrifugazione utilizzando il seguente ordine di frazioni di iodixanol: 8 mL di iodixanol di 15%, 5,5 mL di iodixanol di 25%, 5 mL di iodixanol di 40% e 4,5 mL di iodixanol di 60%.Attenzione: Iodixanol può causare irritazione agli occhi, la pelle e i tratti gastrointestinali e respiratorie. Durante la manipolazione di iodixanol, indossare guanti e lavorare sotto cappa a flusso laminare. Pipettare 8 mL di 15% iodixanol in ogni provetta ultracentrifugazione. Pipettare 5,5 mL di soluzione al 25% di iodixanol in un tubo conico di pulito 50 mL (Figura 1A). Utilizzare una pipetta di Pasteur non graduata (come il collo del tubo ultracentrifugazione è troppo stretto per pipette graduate convenzionale) per dosare attentamente 5,5 mL della soluzione di iodixanol di 25% di sotto del 15% iodixanol soluzione (Figura 1B).Nota: Questo può essere raggiunto con successo aggiungendo il iodixanol in tre fasi, dal momento che la pipetta di Pasteur può contenere solo circa 2 mL. Aggiungere le soluzioni di iodixanol 40% e 60% come descritto nel passaggio 2.9.3. Non disturbare le interfacce diverse iodixanol durante la stratificazione.Nota: La corretta preparazione delle frazioni differenti iodixanol può essere assicurata dalla conferma visiva grazie il rosso fenolo aggiunto per le frazioni di iodixanol (vedere le istruzioni riportate in tabella 1). Dal momento che ogni frazione ha una densità specifica, verrà non intermix durante la fase di stratificazione, se viene eseguita correttamente (Vedi Figura 1). Strato il greggio lisato sopra il gradiente di iodixanol di 15% con una pipetta Pasteur. Procedere goccia a goccia per non disturbare l’interfaccia tra il greggio lisato e la soluzione di iodixanol. Riempire il tubo di ultracentrifugazione con buffer di lisi finché il menisco raggiunge la base del collo del tubo per garantire che il tubo non crollare sotto le altissime forze generate durante l’ultracentrifugazione (Figura 1). Chiudere i tubi di ultracentrifugazione utilizzando coperchi appropriati. Utilizzare una bilancia digitale per assicurarsi che tutti i tre tubi di ultracentrifugazione hanno lo stesso peso. Se necessario, regolare il peso, aggiungendo più buffer di lisi in cima il ‘lysato grezzo’.Nota: La differenza di peso tra i tubi di ultracentrifugazione deve essere inferiore a 0,1 g per garantire il funzionamento sicuro dell’ultracentrifuga. Ultracentrifughe sono potenzialmente pericolosi pezzi di attrezzatura e devono essere utilizzati solo da personale adeguatamente addestrato. Centrifugare le provette a 301.580 x g, utilizzando un rotore ad angolo fisso titanio, per 1 h e 40 min a 12 ° C, utilizzando la massima velocità di accelerazione e decelerazione. Inserire delicatamente un ago smussato in acciaio inox al 40% e 60% iodixanol interfaccia. Inserire l’ago di una siringa da 5 mL (Figura 1E). Aspirare solo la frazione chiara, contenente le particelle di vettore.Nota: Il volume totale raccolto è di circa 2,5-3 mL. Evitare la raccolta di materiale dall’interfaccia 25 – 40%, dato che ciò consentirà di aumentare il livello di contaminazione del batch di vettore finale, a causa della presenza di proteine non auspicabile. Elaborare la frazione raccolta (desalificazione e concentrazione) o conservarlo durante la notte a 4 ° C. Figura 1: installazione per iodixanol gradiente purificazione e accumulazione di vettore successivo. (A) prima di pipettaggio le pendenze di iodixanol diversi nella provetta ultracentrifugazione, Pipettare un adeguato volume di ogni soluzione di iodixanol in un tubo conico separato. (B) quindi utilizzare un Pasteur pipetta di trasferire in sequenza ogni soluzione di iodixanol per il tubo di ultracentrifugazione: strati di una concentrazione di iodixanol sempre più alta devono essere aggiunto nella parte inferiore del tubo sotto i layer precedenti. Strato (C) il vettore grezzo lisato sulla parte superiore una volta la sfumatura è stato preparato. Questo sistema di raccolta del vettore non utilizza aghi taglienti, che presentano un rischio di ‘ ferite ‘. (D), una in acciaio inox 316-siringa ago viene inserito attraverso il gradiente di iodixanol fino all’interfaccia di iodixanol di 40/60%. (E) Vector particelle si trovano nella fase di iodixanol di 40% e sono raccolti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. la dissalazione e la concentrazione del vettore AAV Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo impiegano circa 2 ore. Sciacquare il filtro a membrana del filtro centrifugo aggiungendo 5 mL di 1X PBS-MK e centrifugare per 5 min a 4.000 x g. Aggiungere 5 mL di 1X PBS-MK per la frazione di vettore AAV raccolta, mescolare e poi aggiungere il volume totale per il filtro. Con l’aggiunta di 1X PBS-MK, torbidità è osservato. Centrifuga a 4.000 x g fino a quando il volume presente sul filtro a cono è stato ridotto a 1 mL. Scartare il flusso continuo accumulato nel tubo di raccolta esterna. Aggiungere 13 mL di 1X PBS-MK per il filtro a cono e ripetere la centrifugazione passo tante volte quanto necessario (minimo x 3), finché non ci è nessuna torbidità più osservata quando fresco 1X PBS-MK è aggiunto. In finale lavare passaggio, aggiungere 13 mL di PBS + 0,01% (v/v) di tensioattivo non ionico e centrifugare a 4.000 x g , fino a quando il volume è ridotto a 300 – 350 µ l. Raccogliere la restante frazione presente sul filtro pipettando il volume intero in una provetta sterile costeggiava microcentrifuga.Nota: Questa frazione contiene il vettore AAV dissalato e concentrato. Nei passaggi seguenti del presente protocollo, questa frazione è denominata la frazione ‘primaria’. Assicurarsi di gestire il tubo sotto il cofano e conservare a 4 ° C. Risciacquare il filtro con 200 µ l di 1 x PBS-MK per raccogliere le particelle di vettore residuo trattenute sul filtro. Raccogliere in una microcentrifuga sterile.Nota: Si tratta di uno stock di vettore diluito, che può essere adatto per alcune applicazioni che richiedono i titoli più bassi di vettore. In futuri passi, questa frazione è denominata la frazione ‘secondaria’. Per lo stoccaggio a breve termine, archiviare il vettore fraction(s) a 4 ° C (meno di 2 settimane). Aliquotare e archivio il vettore a ‑ 20 ° C quando il deposito a lungo termine è necessario. Eseguire il controllo di qualità come descritto nella sezione 4. 4. titolazione del vettore da reazione a catena della polimerasi quantitativa Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo prende circa 3 h. Curva standard Linearizzare il plasmide di espressione del transgene (pTransgene) utilizzato per la transfezione delle cellule HEK 293T nella sezione 1. Preparare la miscela di digest di restrizione in una microcentrifuga 0,5 mL (fare riferimento alla tabella 2 per la composizione del mix di digest di restrizione).Nota: Regolare la composizione del mix del digest restrizione secondo l’enzima utilizzato e le relative linee guida dal produttore. Incubare il mix di digest di restrizione per 1h a 37 ° C. Controllare l’efficienza della digestione restrizione eseguendo il plasmide linearizzato su gel di agarosio 0.8% (p/v) a 100 V per digestione completa di 1 h. del plasmide dovrebbe produrre un singolo frammento di dimensione definita. Purificare il plasmide lineare DNA utilizzando un kit di purificazione di PCR, seguito istruzioni24, del produttore e misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro misurando l’assorbimento a 260 nm. Dopo la titolazione, conservare la restante aliquota del plasmide lineare a ‑ 20 ° C per un ulteriore uso. Calcolare le molecole (cioè copie di DNA) dello stock del plasmide per microlitro come segue. In primo luogo, calcolare il peso molecolare del plasmide. Supponendo che il peso medio di una coppia di basi (bp) di DNA è 650 Dalton (Da) e che una mole di un bp pesa 650g, si possono stimare il peso molecolare di qualsiasi modello di DNA double-stranded prendendo il prodotto della sua lunghezza (in bp) e il peso per coppia di basi.Peso molecolare di plasmide [g/mol] = dimensione del plasmide [bp] x 650 [Da/bp] Successivamente, calcolare il numero di moli del plasmide per microlitro.Talpe del plasmide per microlitro = concentrazione di plasmide [g / µ l] / plasmide peso molecolare [g/mol]Nota: L’inverso del peso molecolare è il numero di moli del plasmide presente in 1 g di materiale. Quindi, calcolare il numero di molecole di plasmide per microlitro, utilizzando il numero di Avogadro (6.022 x 1023 molecole/mole).Molecole del plasmide per microlitro = talpe del plasmide per microlitro [talpe / µ l] x numero di Avogadro [molecole/mole] Infine, diluire lo stock di plasmide (molecole / µ l) per ottenere un 100 µ l di soluzione con la concentrazione di 1 x 109 molecole (vettore genomi (vg) per microlitro) desiderata.Stock di plasmide (100 µ l) = (concentrazione desiderata [molecole / µ l] x 100 µ l) / molecole plasmide [molecole / µ l] Effettuare diluizioni seriali dello stock del plasmide (1 x 109 vg / µ l) in triplici copie:10 µ l di brodo di plasmide vg / µ l di 1 x 109 + 90 µ l di H2O = 1 x 108 vg / µ l soluzione10 µ l di diluizione di 1 x 108 vg / µ l + 90 µ l di H2O = 1 x 107 vg / µ l soluzione10 µ l di diluizione di 1 x 107 vg / µ l + 90 µ l di H2O = 1 x 106 vg / µ l soluzione10 µ l di diluizione di 1 x 106 vg / µ l + 90 µ l di H2O = 1 x 105 vg / µ l soluzioneContinuare ottenere una soluzione di 1 x 101 vg / µ l. Mantenere le diluizioni seriali dello stock standard plasmide su ghiaccio fino al loro caricamento sul piatto qPCR (vedere paragrafo 4.3). Componente Importo enzima di restrizione tampone 10x 5 Μ l Enzima di restrizione 2,5 Μ l Plasmide 5 µ g H2O fino a 50 µ l Tabella 2: Composizione mix restrizione del digest. Tabella 3: calcolatore di volume del plasmide Stock. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella. Estrazione del DNA dal vettore AAV Mescolare 2 µ l dell’AAV vector stock (la frazione primaria dal punto 3.5) con 198 µ l della dnasi I buffer (1x) in tubi in striscia (provette per PCR) e aggiungere 2 µ l di dnasi I.Nota: Dnasi che si degrada qualsiasi materiale genetico che non è contenuto all’interno di un capside del vettore (che falserebbe i risultati qPCR). Questa soluzione è denominata diluizione ‘dil1 x 10-2′. Incubare per 30 min a 37 ° C, seguita da 10 min a 95 ° C.Nota: Il protocollo può essere interrotta a questo punto e il materiale può essere conservato a tempo indeterminato a 4 ° C, per evitare il deterioramento del prodotto. Aggiungere 2 µ l di proteinasi K per la soluzione di dil1 x 10-2 (punto 4.2.1) e incubare per 60 min a 50 ° C, seguita da 20 min a 95 ° C.Nota: Questo passaggio sarà smontare il capside del vettore AAV e rilasciare il genoma di vettore AAV nella soluzione. Aggiungere proteinasi K in eccesso come il contenuto del campione proteico (capside) non è noto. Si noti che è essenziale per garantire che tutte le attività di proteinasi K viene rimosso dalla denaturazione, prima del qPCR, per evitare problemi di degradazione (parziale) della polimerasi che influenzano il risultato finale. 01:10 preparare diluizioni seriali della proteinasi K trattati dil1 x 10-2 soluzione (punto 4.2.3) in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, come segue:10 µ l di dil1 x 10-2 + 90 µ l di H2O = diluizione dil1 x 10-3 10 µ l di dil1 x 10-3 + 90 µ l di H2O = diluizione dil1 x 10-410 µ l of dil1 x 10-4 + 90 µ l di H2O = diluizione dil1 x 10-5 Mantenere le diluizioni seriali di DNA estratto dal vettore sul ghiaccio fino al loro caricamento sul piatto qPCR (vedere paragrafo 4.3). Titolazione di SYBR Green qPCR basati sul rilevamento Preparare il mix master qPCR in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, sia per il campione e gli standard. Utilizzare 10 µ l di SYBR Green Master Mix, 1 µ l di primer forward (stock di 10 µM), 1 µ l di primer reverse (stock 10 µM) e 3 µ l di H2O per reazione. Vedi il protocollo nella tabella 4 per sequenze dell’iniettore. Pipettare il mix master qPCR su e giù, ma non centrifugare. Aggiungere 15 µ l di mix master qPCR, seguito da entrambi 5 µ l di curva standard preparata nella sezione 4.1 o il DNA estratto dal vettore AAV nella sezione 4.2, in ciascun pozzetto. Includono tre pozzetti contenenti solo il mix master della qPCR, come controllo negativo. Fare riferimento alla Figura 2 per il layout di piastra. Sigillare la piastra con una pellicola sigillante e centrifugare brevemente la piastra qPCR a 1.500 x g per 30 s a 4 ° C. Eseguire la reazione di qPCR su una piastra-base in tempo reale PCR amplificazione e rilevazione dello strumento, utilizzando le condizioni suggerite in tabella 5. Nome di primer Sequenza Forward primer 5′-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3′ Reverse primer 5′-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3′ Tabella 4: Sequenze Primer progettate contro il promotore CBA. Figura 2: layout di piastra per titolazione vettoriale basato su qPCR. I campioni sono a colori: verde = curva standard; Blu = H2O controllo; grigio = frazione primario; arancione = frazione secondaria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Passo Tempo Temperatura Cicli Obiettivo Pre-incubazione 5 min 95 ° C X1 DNA polimerasi e denaturazione attivazione (reazione di avviamento a caldo). Amplificazione 10 min 95 ° C X1 Amplificazione del DNA. Impostazioni potrebbero essere ottimizzate se vengono utilizzati primers alternativi con diversa temperatura di ricottura. 10 s 95 ° C X40 40 s 60 ° C 1 s 72 ° C Di raffreddamento 10 s 40 ° C X1 Piastra di raffreddamento. Fine della PCR. Tabella 5: Protocollo termale in bicicletta per la titolazione di SYBR qPCR base verde. Analisi dei dati per determinarne il titolo di vettore AAV Riempire le celle di dati del foglio di calcolo (tabella 6A) con i valori di Ct ottenuti per le diverse diluizioni del campione di riferimento preparati nella sezione 4.1 per generare una curva standard.Nota: Verrà mostrata l’equazione della curva standard (y = un ln (x) + b) insieme con l’efficienza di2 R(tabella 6B). Una qPCR deve avere un’efficienza vicina al 100% e R2 vicino a 1.0 (≥ 0,96). Utilizzare i valori calcolati di a e b per riempire le celle di dati corrispondenti nel foglio di calcolo (tabella 6). Completare il foglio di calcolo con i valori di Ct ottenuti per le diverse diluizioni del campione AAV preparato nella sezione 4.2. Calcolare il titolo di vettore AAV medio in genomi di vettore per microliter della frazione’ primaria’ utilizzando la seguente formula:Nota: il fattore 400 è utilizzato per singoli incagliati genomi, mentre genomi sc utilizzano un fattore di moltiplicazione di 20025. In realtà, come quantità di DNA doppio durante ogni ciclo di qPCR, sc che DNA è rilevato 2 x rispetto ad un genoma di ss. Lo scopo della titolazione consiste nel calcolare la concentrazione in termini di genomi di vettore per microlitro. Una correzione è necessaria per l’esecuzione la qPCR quando utilizzando 2 µ l di materiale (punto 4.2.1) di partenza. dil rappresenta i fattori di diluizione dal punto 4.2.4. Il titolo della ‘secondario’ frazione vettore AAV (punto 3.6) può essere calcolato simultaneamente. Tabella 6: modello per l’analisi dei dati di qPCR. Per favore clicca qui per scaricare questo file. 5. purezza controllo da SDS-PAGE e macchiatura d’argento Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo prende circa 5 h. Utilizzare etanolo al 70% (v/v) per pulire accuratamente le lastre di vetro utilizzate per la colata di gel. Assemblare il sistema di colata di gel. Garantire che i fondi delle lastre vetrate non sono scheggiati, per evitare perdite della miscela acrilammide nel cast del gel. Preparare l’accatastamento e separano le soluzioni gel di risoluzione in due provette coniche da 50 mL. Omettere il tetrametiletilendiammina (TEMED) e il 10% (p/v) ammonio persolfato (APS), come essi sono responsabili per la polimerizzazione del gel. Aggiungerli immediatamente prima del getto il gel.Nota: La percentuale finale di acrilammide nel gel influenza il profilo di separazione delle proteine: in genere, una concentrazione finale di 10% (v/v) di acrilammide sarà sufficiente per testare la purezza di una preparazione di vettore AAV. Miscelare delicatamente agitando il tubo contenente i componenti del gel. Non centrifugare, poiché l’ossigenazione eccessiva può compromettere la polimerizzazione. Aggiungere TEMED e 10% (w/v) APS per la soluzione di gel di risoluzione. Mescolare e poi versare in titolare del gel fino a quando non raggiunge 1-2 cm sotto la parte superiore della piastra piccolo bicchiere. Mettere uno strato di butanolo saturo d’acqua sulla parte superiore la miscela di acrilammide. In tal modo la formazione di una superficie piana durante la polimerizzazione. Non lasciare il gel sotto alcol per più di 30 min in quanto consente di disidratare il gel e compromettere il funzionamento.Attenzione: Butanolo è pericoloso in caso di contatto con la pelle. Presenta anche un rischio di incendio. Maneggiare con cura. Attendere che il gel per polimerizzare e poi versare il butanolo. Suggerimento: Controllare per vedere se il mix di gel in eccesso nel tubo ha solidificato. Polimerizzazione si verifica in meno di 20 min. lavare la superficie del gel con H2O e poi asciugare con asciugamani di carta, facendo attenzione a non per disturbare la superficie del gel. Aggiungere TEMED e 10% (w/v) APS per il gel d’impilamento e versare il gel nel supporto gel sulla superficie del gel di separazione. Posizionare il pettine fornito in gel. Eseguire questa azione con un movimento costante per evitare la formazione di bolle d’aria all’interno dei pozzetti. Attendere almeno 20 min per il gel di polimerizzare. Suggerimento: Controllare che se il gel in eccesso mix di tubo conico ha solidificato. Preparare i due missaggi (tabella 7) per sia il primario e il secondario AAV vettore frazioni (punti 3.5 e 3.6, rispettivamente). Elevata quantità Bassa quantità Stock di vettore AAV 5 Μ l 1 Μ l Sample buffer 5x 3 Μ l 3 Μ l H2O 7 Μ l 11 Μ l Tabella 7: Composizione delle miscele campione richiesto per la macchiatura d’argento. Completamente denaturare le miscele campione di riscaldamento li per 5 min a 95 ° C. Montare il serbatoio di elettroforesi, prestando attenzione all’orientamento dell’elettrodo. Riempire il serbatoio con 1x buffer di catodo all’interno dell’Assemblea dell’elettrodo e 1 x anodo tampone all’esterno.Nota: Anodo buffer può essere riciclato da run-to-run. Buffer di catodo fresco deve essere sempre utilizzato. Rimuovere il pettine dal gel e pulire i pozzetti del gel con buffer di 1x catodo. Caricare 1 µ l di scaletta della proteina in un pozzo. Caricare le miscele di campione in diversi pozzi sullo stesso gel (Figura 3). Esegua il gel a 50 V fino a quando i campioni immettere il gel di risoluzione. Quindi aumentare la tensione a 100 V fino a quando il fronte di tintura raggiunge il limite inferiore del gel. Estrarre con cura il gel da lastre di vetro e utilizzare l’argento colorazione kit (secondo istruzioni26) del produttore per visualizzare le proteine virali (VP1, VP2 e VP3 subunità) che compongono il capside AAV, anche quanto a controllare per possibili contaminazione della proteina (Figura 3). Figura 3: valutazione della purezza vettoriale mediante SDS-PAGE e macchiatura d’argento. Utilizzando un gel Tricine-SDS, 5 µ l di varie preparazioni di vettore sono stati separati. Proteine sono state successivamente rilevate dalla macchiatura d’argento. Vettori sono considerati puri VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) e VP3 (60 kDa) sono visibili in un 1:1:10 ratio (lane 1), senza fondo eccessiva (lane 2) o fasce non specifiche (corsia 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

AAV9 è stato considerato, fino a poco tempo, per essere il più efficace sierotipo di vettore AAV di attraversare la BBB e transducing cellule del SNC, dopo somministrazione periferica. Un significativo passo avanti nel design del capsid è stato raggiunto quando Deverman et al ha riferito l’uso di un metodo di selezione del capsid denominato Cre basati su ricombinazione AAV-mirati evoluzione (Crea)17. Utilizzando questo metodo, hanno identificato un nuovo capside, denominato PHP. B, che hanno riferito come in grado di trasdurre la maggior parte degli astrociti e neuroni in più regioni dello SNC, dopo iniezione sistemica17. A questo punto, dovrebbe essere notato che anche se PHP. B fornisce risultati positivi in topi C57/Bl6 (che era il ceppo utilizzato negli esperimenti isolamento iniziale), rapporti preliminari suggeriscono la che sua efficienza può variare in un modo dipendente dalla deformazione. Ulteriori esperimenti saranno, senza dubbio, fare più luce su questo problema31. Tuttavia, nonostante questi problemi, PHP. B offre interessanti possibilità per la manipolazione del gene non invadente nel SNC di topi, compresi gli esperimenti di terapia genica proof-of-concept in modelli di malattia. Come tale, abbiamo scelto di valutare l’efficienza di espressione del transgene utilizzando PHP. B contro AAV9, che è stato il vettore ‘gold standard’ per la trasduzione di CNS dopo somministrazione periferica dal 20092. Per eseguire un confronto diretto dei due sierotipi, in condizioni ottimali per l’espressione del transgene, abbiamo utilizzato un modulo di configurazione di genoma sc32. Entrambi i vettori ha trasportato il transgene per proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore onnipresente pollo β-actina (CBA). Topi C57/Bl6 femminili al giorno postnatale 42 (circa 20 g di peso) hanno ricevuto una dose di 1 x 1012 vg per topo di entrambi scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP. Amministrazione di vettore è stata eseguita tramite iniezione della vena della coda. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico di KU Leuven. Postinjection di tre settimane, i topi hanno subito perfusione perfusione con PBS ghiacciata, seguita da 4% (p/v) ghiacciata paraformaldeide (PFA). I loro cervelli sono state raccolte e subì ulteriori postfixation da un’incubazione overnight nel fissativo stesso, prima del trasferimento a 0,01% (p/v) Na-azide/PBS per deposito fino a ulteriori analisi. In seguito, i cervelli sono stati sezionati usando un microtomo vibra e immunohistochemistry è stato effettuato su 50 µm sezioni spesse. Per valutare i livelli di espressione del transgene, sezioni sono state macchiate con gli anticorpi primari contro GFP (coniglio anti-GFP), con il rilevamento utilizzando anticorpi secondari coniugati a una tintura fluorescente (anti-coniglio Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Misure di intensità di fluorescenza (in unità arbitrarie [au]) ha confermato un significativo aumento nell’espressione di GFP quando un sc genoma e PHP. Capside di B sono stati utilizzati rispetto al AAV9. Sono stati osservati aumenti GFP nel cervello (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0,0032), il cervelletto (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0,0032) e del tronco cerebrale (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (Figura 4). Figura 4: consegna sistemica di scAAV2/PHP. B-CBA-GFP conduce ad un’alta espressione di GFP nello SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mouse) è stato amministrato ai topi C57/Bl6 6 settimane-vecchio tramite iniezione della vena della coda. GFP è stato rilevato usando immunohistochemistry su postinjection di 3 settimane sezioni coronali del cervello. (A) il cervello e (B) sono mostrati il cervelletto e il tronco cerebrale. Scala bar = 1 mm. (C) la quantificazione dell’intensità di fluorescenza relativa è stata eseguita per determinare i livelli di segnale GFP raggiunto con ogni vettore (10 sezioni per topo; tre topi per gruppo vettoriale). È stato effettuato un test ANOVA unidirezionale, seguiti da t di uno studente due code-test; i dati sono espressi come media ± deviazione standard; p < 0.01; au. unità arbitrarie. pCapsid, utilizzato per la produzione di vettore AAV, contiene il gene rep da sierotipo 2 e del gene tappo da sierotipo PHP. B o AAV9, di conseguenza. Questa figura è stata modificata da Rincon et al.32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La produzione di vettori ricombinanti AAV qui descritto utilizza materiali e attrezzature comuni alla maggior parte dei laboratori di biologia molecolare e cellulare cultura servizi. Permette all’utente di ottenere i vettori AAV puro, preclinici grado che possono essere utilizzati per più tipi di cellule e tessuti di destinazione attraverso una gamma di applicazioni in vitro e in vivo . Uno dei più grandi vantaggi di questo protocollo, rispetto ad altri (cioè, CsCl purificazione), è il più breve tempo di lavoro necessario. I vettori AAV Ready-to-use sono ottenibili in un massimo di 6 giorni lavorativi dopo la transfezione iniziale di HEK293T cellule.

Diversi fattori possono influenzare negativamente la resa finale o la qualità del vettore AAV. Efficienza di trasfezione povero è uno dei motivi principali per una bassa resa virale33. Una raccomandazione importante è l’uso di HEK293T cellule che non sono state attraversate più di 20 volte e non hanno una confluenza di cella supera al 90% al momento della trasfezione21. Inoltre, il metodo di transfezione selezionato ha un impatto significativo sui risultati. Questo protocollo è basato sull’uso di PEI. PEI è un polimero cationico con la capacità di trasportare DNA esogeno al nucleo della cellula attraverso la generazione di complessi di polimero e dell’acido nucleico, noto come polyplexes, che sono presi dalla cella e trafficata via gli endosomi34. Basato su PEI transfezione è facile e veloce da eseguire, in contrasto con altri metodi ampiamente usati, ad esempio la co-precipitazione del DNA con fosfato di calcio35. Inoltre, trasfezione basata su PEI è molto più conveniente rispetto ad altri metodi recentemente introdotti, come l’utilizzo di lipidi cationici e transfezione mediata magnete36.

La strategia di purificazione svolge un ruolo chiave nel protocollo. Rispetto ad altri metodi, basati su iodixanol purificazioni tendono a contenere una percentuale più elevata di particelle virali vuoto (20%)20. Questo è compensato, ad un grado, dal fatto che la purificazione iodixanol risultati ordinariamente nelle preparazioni di vettore AAV con un rapporto di particella di infettività di meno di 100. Questo rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai convenzionali procedure basate su CsCl, per il quale perdita sostanziale di infettività delle particelle è segnalato37. Un altro metodo alternativo comune per purificare i vettori di AAV è purificazione basato su cromatografia. Tuttavia, questo metodo ha il grande svantaggio che una colonna specifica è necessaria per ogni capside del vettore utilizzato: ad esempio, mentre AAV2 è classicamente isolato utilizzando colonne di eparina, questa metodologia non funziona con AAV4 e AAV5, che non possiedono eparina-legante siti su loro capsidi38. Considerando che la purificazione di cromatografia è anche costoso, purificazione iodixanol è generalmente più adatto per i laboratori che desiderano produrre lotti di alta qualità di vettori AAV su una piccola scala33,39, 40. Tuttavia, per ottimizzare la resa finale e la purezza del vettore, estrema cura è necessaria quando si effettuano le pendenze di iodixanol. Le varie frazioni di iodixanol dovrebbero essere trasferite al tubo di ultracentrifugazione mediante una pipetta Pasteur sterile cui punta è a contatto della parete del tubo: iodixanol dovrebbero essere espulse dalla pipetta lentamente e continuamente. Come le particelle di vettore si accumulano nello strato iodixanol 40%, cura deve essere adottate per garantire che le interfacce di gradiente non mescolano20. Infine, la frazione contenente il vettore dovrebbe essere recuperata tramite l’inserzione di un ago smussato in acciaio inox con un calibro non superiore a 20 G. Per massimizzare il recupero di vettore, la frazione chiara deve essere recuperata nella sua interezza. Durante questo passaggio, il tempismo è fondamentale. Per evitare di compromettere la purezza della preparazione, è essenziale per interrompere la raccolta prima che altre fasi (contaminanti) della sfumatura sono raccolti.

Differenze nel titolo vettore ottenuti possono essere attribuite anche alla capacità intrinseca del vettore di produrre particelle confezionate. Un confronto tra diversi sierotipi di AAV hanno mostrato che alcuni vettori AAV sono più difficili da produrre ad un titolo più elevato rispetto ad altri (ad es., AAV2)41. Precipitazione del vettore, durante la fase di dissalazione, può essere un motivo possibile per un titolo inferiore e facilmente prevenuta evitando sovraconcentrazione33. Inoltre, è anche possibile che l’efficienza di iodixanol basati su gradiente purificazione differisce leggermente tra sierotipi e, di conseguenza, le discrepanze nel titolo ottenuti con diversi sierotipi possono essere osservate41.

Infine, occorre sottolineare che, anche se qPCR è un metodo molto preciso per la quantificazione del DNA certa variabilità insita nella tecnica può essere osservato. Precisione nella titolazione dipende in primo luogo il pipettaggio precisa e corretta nel Vortex di tutte le soluzioni. Per garantire il titolo più accurato lettura, la qPCR può essere ripetuta in modo indipendente, e i valori ottenuti in media. La scelta dei primer presentato in questo protocollo si basa sulla sequenza del promotore CBA situato nel plasmide pTransgene utilizzato nel nostro laboratorio. Il promotore CBA è un forte promotore sintetico che è ampiamente usato nel campo vettoriale per espressione di unità in più tipi di cellule. Esso incorpora elementi multipli, compreso l’elemento enhancer precoce del citomegalovirus (CMV); il promotore, primo esone e primo introne del gene CBA; e il ricettore della giuntura del gene della β-globina coniglio. Tuttavia, gli iniettori possono essere progettati per praticamente qualsiasi elemento che si trova all’interno della cassetta di espressione (compreso il promotore, il transgene ed elementi regolatori). Il confronto del titolo in batch è possibile, anche fornendo gli iniettori sono utilizzati contro le regioni comuni per i vettori in questione.

In conclusione, questo protocollo può essere usato per produrre vettori AAV con una varietà di capsidi, configurazioni del genoma, tipi di promotore e transgene carichi. Questo permetterà agli utenti di adattare facilmente le caratteristiche finali dei loro vettori base alle esigenze sperimentali. Nell’esempio presentato nei risultati rappresentativi, l’uso del PHP. Capside di B, che attraversa in modo efficiente la BBB, ha dato espressione genica altamente efficiente nel SNC, seguente coda vena iniezione32. La somministrazione sistemica di vettori penetranti CNS ha notevoli vantaggi in termini di possibili effetti collaterali2,17,32. Una possibile alternativa all’iniezione periferica, evitando i caveat di tecniche invasive, è consegna intrathecal, che consiste di consegna del vettore AAV nel fluido cerebrospinale. Questo itinerario di consegna è dimostrato di essere efficace, mostrando diffusa espressione del transgene in tutto il sistema nervoso centrale, effetti meno fuori bersaglio in organi periferici e bassi livelli di risposta immunitaria42. Tuttavia, iniezioni intratecali sono molto più impegnativo, in quanto richiedono maggiore abilità tecniche di iniezione della vena della coda.

Ulteriore sviluppo di capside a perfezionare questa tecnologia sarà guidato dall’opportunità di utilizzo di vettore AAV in applicazioni di terapia genica. Tali approcci offrono interessanti possibilità per trattare disturbi di CNS attualmente incurabili, come la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth, morbo di Parkinson e morbo di Alzheimer18.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.R. è supportato da un Fonds voor borsa di studio post-dottorato Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) e riconosce il continuo sostegno della Fundación cardiovascolare de Colombia e il dipartimento di scienza amministrativa, Tecnologia e innovazione (Grant CT-FP44842-307-2016, codice progetto 656671250485). M.m. è supportato da una borsa di studio dottorato FWO (1S48018N). M.G.H. è stato sostenuto da un grant istituzionali VIB e il supporto esterno da Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), la Fondazione per la ricerca di Alzheimer (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) e il Consiglio europeo della ricerca (CER) (Starting Grant 281961 – AstroFunc; Prova di concetto Grant 713755 – annuncio-VIP). Gli autori riconoscono Jeason Haughton per il suo aiuto con allevamento del mouse, Stephanie Castaldo per il suo aiuto eseguire le iniezioni di vena di coda e Caroline Eykens per fornire le immagini delle cellule transfected HEK293T. M.G.H. riconosce Michael Dunlop, Peter Hickman e Dean Harrison.

Materials

Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100X) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic System 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37°C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Co2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Filter tips * Greiner bio-one 750257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Filter tips * Greiner bio-one 738257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Filter tips * Greiner bio-one 771257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F144801
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123600
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123615
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123601
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.
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Referenzen

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Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).
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