הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

פתרון קומפוזיציה תרבית תאים, תרביות תאים DMEM1 DMEM 1 x 1% FBS (v/v) 1% GlutaMAX (וי/v) DMEM10 DMEM 1 x 10% FBS (v/v) 1% GlutaMAX (וי/v) 150 מ מ NaCl 4.380 g NaCl עד 500 מ”ל מים הנדסה גנטית Desalting וטיהור AAV NaCl 5 מ’ 146.1 g NaCl עד 500 מ”ל מים הנדסה גנטית 1 מ’ טריס HCl (pH 8.5) בסיס טריס 12.11 g זהירות עד 100 מ ל מים הנדסה גנטית להוסיף 1 HCl M באמצעות פיפטה פסטר כדי לצמצם את רמת ה-pH 8.5 מאגר פירוק 15 מ”ל של NaCl 5 מ’ 25 מ של 1 מ’ טריס HCl (pH 8.5) זהירות עד 500 מ”ל מים הנדסה גנטית 10 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 80 גר’ NaCl 2 גרם אשלגן כלורי זהירות 14.4 g נה2HPO4 2.4 g ח’2PO4 עד 1 מים ddL MgCl 1 מ’2 20.33 g MgCl2-6 H2O עד 100 מ ל מים הנדסה גנטית אשלגן כלורי 1 מ’ 7.45 גרם אשלגן כלורי זהירות עד 100 מ ל מים הנדסה גנטית 5 x פתרון מניות PBS מגנזיום אשלגן (PBS-ח”כ) 250 מ של 10 x PBS 2.5 מ של MgCl 1 מ’2 6.25 מ של 1 מ’ אשלגן כלורי זהירות למעלה עד 500 מ”ל מים Ultrapure H2O 15% Iodixanol מ”ל של Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע זהירות 10 מ”ל של NaCl 5 מ’ 10 מ”ל של 5 x PBS-ח”כ 17.5 מ ל מים הנדסה גנטית 25% Iodixanol 20.8 מ של Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע זהירות 10 מ”ל של 5 x PBS-ח”כ 19.2 מ ל מים הנדסה גנטית µL 100 של פנול אדום 40% Iodixanol 33.3 מיליליטר Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע זהירות 10 מ”ל של 5 x PBS-ח”כ 6.7 מ ל מים הנדסה גנטית 60% Iodixanol 50 מ של Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע זהירות µL 100 של פנול אדום זהירות AAV טוהר שליטה 10 x טריס אצטט EDTA (תה) מאגר 44.8 g טריס בסיס זהירות חומצה אצטית 11.4 mL (17.4M) 3.7 גרם EDTA עד 1 מים הנדסה גנטית L Agarose ג’ל agarose הנדסה גנטית 0.8 g עד 100 מ ל 1 x תה מאגר מאגר ג’ל 181.7 g טריס בסיס זהירות 1.5 g למען חברה דמוקרטית זהירות להתאים את ה-pH ל 8.45 עם 1 M HCl זהירות עד 500 מ”ל מים הנדסה גנטית קטודה מאגר 10 x בסיס טריס 121.14 g זהירות 179.2 g Tricine זהירות 1% מרחביות (w/w) זהירות עד 1 מים הנדסה גנטית L אנודת מאגר 10 x בסיס טריס 242.3 g זהירות עד 1 מים הנדסה גנטית L להתאים את ה-pH ל 8.9 עם 1 M HCl זהירות לדוגמה מאגר 5 x עבור 20 מ: בסיס טריס 605 מ ג זהירות 4 g למען חברה דמוקרטית זהירות 10 מ ג Serva בלו ז 12 גרם גליצרול להתאים את ה-pH ל 6.8 עם 1 M HCl, aliquot ולאחסן ב-20 ° C זהירות ג’ל הערימה עבור 2 ג’לים: אקרילאמיד 400 µL זהירות מאגר ג’ל 750 µL 1.85 מ ל מים הנדסה גנטית TEMED 4 ΜL זהירות 20 µL 10% APS (v/v) זהירות להוסיף TEMED ו-10% APS מיד לפני לשפוך את הג’ל. השתמש בשני כימיקלים ברדס כימי. פתרון ג’ל עבור 2 ג’לים: 3.32 mL אקרילאמיד זהירות 3.35 מ ל ג’ל מאגר 1.14 מ”ל מים הנדסה גנטית 2.12 מ ל 50% גליצרול TEMED 6 ΜL זהירות 50 µL 10% APS (w/v) זהירות להוסיף TEMED ו-10% APS מיד לפני לשפוך את הג’ל. השתמש בשני כימיקלים ברדס כימי. Butanol רווי מים 10 מ ל n-butanol זהירות 1 מ”ל מים הנדסה גנטית התראה: עיין בטבלה חומרים לקבלת הנחיות על השימוש של כימיקלים מסוכנים. טבלה 1: ההרכב של הפתרונות הנדרשים. 1. Tri-תקנים של תאים HEK293T הערה: נא עיין טבלה 1 להרכב של מאגרים, פתרונות שימוש בפרוטוקול.הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול לוקח כ 4 ימים. הפשרת בקבוקון של כליה אנושית עובריים (HEK) תאים 293T באמבט מים להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס.הערה: השתמש רק תאים יש כבר passaged פחות מ 20 x כדי להבטיח יעילות אופטימלית תרביות תאים. זרע תאים HEK293T על צפיפות של 2 x 103 6 x 103 תאים/cm2 ב DMEM10 בקוטר 15 ס מ תא תרבות מנות. לגדול תאי זרימה 70 – 80% בחממה סטנדרטי להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס, עם 95% לחות ו-5% CO2.הערה: הייצור של אצווה אחת של וקטורים AAV באמצעות פרוטוקול זה דורש תא 18 תרבות מנות (קוטר 15 ס מ). תא זרימה של 70% – 80% מקביל 6 x 103 7 x 103 תאים/cm2, בהשתתפות 17 – 20 מ של DMEM10 תרבות בינוני. הכנת polyethylenimine (פיי) / אן מערבבים ביחס ריכוז של 1/3.5 (w/w). להכין את התמהיל דנ א 18 מנות תרבות תא בצינור חרוט 50 מ ל אחד על ידי ערבוב 360 µg של pΔF6, 180 µg של pCapsid µg 180 של pTransgene ב- 18 מ של 150 מ מ NaCl. להפיץ את התמהיל DNA מעל שלושה 50 מ ל חרוט צינורות (6 מ של ה-DNA לערבב למחזור חרוט). להכין את תערובת פיי עבור תא שש מנות תרבות צינור חרוטי 50 מ על ידי ערבוב µg 840 של פיי (µg 1/µL) ב- 6 מ של 150 מ מ NaCl. להכין את תערובת פיי/DNA על-ידי הוספת 6 מ של המיקס פיי (להכין בשלב 1.4.3), טיפה על ידי ירידה, באחד הצינורות חרוט המכיל את התמהיל דנ א (להכין בשלב 1.4.2), תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: לאחר 20 דקות של דגירה, המיקס פיי/DNA יהפוך מעט עכורים. קח 6 מנות התרבות התא מתוך החממה, לגמרי מחוק לגמרי האמצעי כל מנה תרבות בתוך תא למינארי. להסיר את העקבות של המדיום בשטיפת הכלים עם 5 מ של תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco prewarmed (DPBS). להבטיח את ההפצה של DPBS על פני השטח כולו בהטיית בעדינות את המנה. בעדינות וארוקן את DPBS ומוסיפים 12 מ של DMEM1 כל מנה.הערה: הימנע ניתוק התאים על-ידי הוספת המדיום אט אט מן פיפטה ממוקם בקצה של המנה. מערבבים את פיי/ה-DNA על-ידי pipetting למעלה ולמטה 3 x – 5 x. להוסיף 2 מ של המיקס פיי/DNA כל אחת מהמנות תרבות six תא באופן טיפה-מאת-שחרור, בזהירות להפיץ אותו על פני השטח כולו. ברגע המיקס מתווסף כל מנה, למקם את הכלים בחזרה בחממה. חזור על צעדים 1.4.3– 1.8 עבור המנות תרבות הנותרים. דגירה את התאים transfected עבור 5 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, עם לחות 95% ו-5% CO2- להוסיף אוטם 12 נוספים של DMEM10 כל מנה תרבות מבלי להסיר את המדיום הקיימת מראש (סה כ נפח בינוני = 25 מ ל). דגירה התאים transfected למעלה כדי 72 h תקנים שלאחר ב 37 מעלות צלזיוס, עם 95% לחות ו-5% CO2. משלים איור 1: מורפולוגיה תאים HEK 293T דמיינו ידי שלב ניגודיות מיקרוסקופ (משמאל) עם אישור של ביטוי GFP דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה (מימין)- (א) תרביות תאים מוצלחת של תאים HEK293T עם pTransgene קידוד ה-GFP אושר על ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה. HEK293T (B) תאים שטופלו אך ורק תרביות תאים ריאגנטים להראות אין ביטוי GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. לקצור את המדיום ולהבין את תרביות תאים של פוסט-72 h תאים. להשתמש במגרדת תא להתנתק בקפידה תאים מן המנה תרבות. לאסוף את המדיום התאים צינור חרוטי 50 מ ל שמר על קרח.הערה: ניתן לאסוף את התוכן של שתי מנות של התרבות תאים לתוך צינור חרוטי בודד 50 מ. בסוף שלב זה, כל אחד הצינורות תשעה יכיל כ 50 מ של מדיום. Centrifuge צינורות חרוט ב x 420 גרם 10 דקות ב 4 ° C עם האצה והאטה לצנטריפוגה מוגדר מקסימום. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע מהצינור כל. אל תשתמש פיפטות כדי למנוע האובדן של חומר. במקום זאת, בעדינות שופכים את תגובת שיקוע לתוך מיכל האשפה ולמקם הצינורות המכילים את כדורי תא בחזרה על הקרח. Resuspend גלולה כל תא ב- 2 מ של פירוק מאגר ישירות בצינור חרוט 50 מ על-ידי pipetting למעלה ולמטה x 5 – 10. לא מערבולת. מאגר של lysates משפופרות שלושה ביחד.הערה: בשלב זה, יהיו 50 מ ל שלוש חרוט, צינורות-כל אחד המכיל 6 מ של התאים resuspended במאגר פירוק. 2. AAV וקטור טיהור הערה: הביצועים של סעיף פרוטוקול זה לוקח כ- 1 יום. בצע את השלבים הבאים בעת ובעונה אחת על כל אחד 50 מ ל שלוש חרוט הצינורות המכילות את התאים resuspended במאגר פירוק (ראה בהערה הקודמת). הקפאה והפשרה התאים resuspended 3 של x lyse אותם ולשחרר את החלקיקים AAV. לבצע את הצעד הקפאה על ידי הנחת הצינורות בתוך דלי המכיל קרח יבש מעורב עם אתנול. לבצע מפשיר על-ידי הצבת מיד את התאים בתוך אמבט מים להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר השלב השלישי המפשיר, צנטריפוגה ב x 1,167 g למשך 15 דקות ב 4 º C.הערה: גלולה מורגש המורכב שאריות תאים יכול להיווצר. בעת טיפול הצינורות, להימנע תנועות פתאומיות כמו אלה יכול לגרום להתנתקות בגדר לתוך תגובת שיקוע, אשר תסכן את הטוהר של הווקטור הסופי. להעביר בזהירות את supernatants כדי לנקות צינורות חרוט 50 מ ל ולאחר מכן להוסיף נוקלאז כל שפופרת, כדי ריכוז סופי של 50 U/mL supernatant. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. מערבולת הצינורות חרוט 50 מ ל בעבודת יד כל 10 דקות כדי להבטיח כי נוקלאז ביסודיות מעורבב עם תגובת שיקוע. להבהיר את תגובת שיקוע על ידי צנטריפוגה ב x 13,490 g למשך 20 דקות ב 4 º C. לצרף מסנן מיקרומטר 0.45 מזרק 10 מ”ל ומניחים אותו על גבי צינור חרוטי נקי 50 מ. בזהירות להסיר את הבוכנה ולמלא את המזרק עם תגובת שיקוע מהשלב 2.5. השתמש הבוכנה כדי לכפות את lysate דרך המסנן. השתמש במסנן חדש עם מזרק לכל שפופרת של תגובת שיקוע שהושג בשלב 2.5.הערה: השבר שהושג המכונה ‘גולמי lysate’. להכין את כל השברים iodixanol 15%, 25%, 40% ו- 60% חרוט ארבעה צינורות נפרדת 50 מ ל, ובהתאם להוראות טבלה 1. להכין את מעברי צבע iodixanol שלושה צינורות ultracentrifugation באמצעות הסדר הבא של שברים iodixanol: 8 מ של 15% iodixanol, 5.5 מ של 25% iodixanol, 5 מ של 40% iodixanol ו- 4.5 מ של 60% iodixanol.התראה: Iodixanol יכול לגרום לגירוי בעיניים, בעור של ספינלי את מערכת העיכול, מערכת הנשימה. בעת טיפול מעברי צבע iodixanol, ללבוש כפפות ולעבוד תחת תא למינארי. פיפטה 8 מ של 15% iodixanol לתוך כל שפופרת ultracentrifugation. פיפטה 5.5 mL של 25% iodixanol פתרון לתוך צינור חרוטי נקי 50 מ ל (איור 1 א’). להשתמש על פיפטה פסטר שאינו בוגר (כמו בצוואר של הצינור ultracentrifugation צר מדי פיפטות בוגר קונבנציונלי) כדי בזהירות שכבה 5.5 mL של הפתרון iodixanol 25% להלן הפתרון iodixanol 15% (איור 1B).הערה: זה יכול להיות בהצלחה מושגת על-ידי הוספת את iodixanol בשלושה צעדים מאז פיפטה פסטר מסוגלת להחזיק רק בסביבות 2 מ”ל. להוסיף 40% ל-60% iodixanol הפתרונות כפי שמתואר בשלב 2.9.3. נא לא להפריע את הממשקים iodixanol שונים במהלך לקרנל.הערה: הכנה נכונה של שברים iodixanol שונים יכול להיות שמחייבות אישור חזותי הודות פנול אדום להוסיף שברים iodixanol (עיין בהוראות טבלה 1). מאז כל שבר יש צפיפות ספציפיים, הם לא התמזגות במהלך השלב לקרנל, אם זה מבוצע כראוי (עיין איור 1C). שכבת הגולמי את lysate על גבי המילוי ההדרגתי iodixanol 15% עם פיפטה פסטר. המשך ירידה על ידי שחרור כדי להימנע מהפרעה הממשק בין הגולמי את lysate ואת הפתרון iodixanol. למלא את הצינור ultracentrifugation פירוק מאגר עד מניסקוס מגיע לבסיס של שפופרת הצוואר על מנת להבטיח שהצינורית לא קרסו תחת הכוחות גבוהה מאוד שנוצרו במהלך ultracentrifugation (איור 1C). סגור את הצינורות ultracentrifugation להשתמש במכסים המתאים. השתמש בקנה מידה דיגיטלי כדי לוודא שלכל הצינורות ultracentrifugation שלושה שיש באותו המשקל. להתאים את המשקל, במידת הצורך, על-ידי הוספת עוד מאגר פירוק מעל ‘גולמי lysate’.הערה: הפרש המשקל בין הצינורות ultracentrifugation חייב להיות מתחת 0.1 g כדי להבטיח את הפעולה בטוחה של ultracentrifuge. Ultracentrifuges אמורה לשמש רק על ידי צוות מיומן כהלכה, הינם חלקים מסוכנים של ציוד. Centrifuge הצינורות ב 301,580 x g, שימוש קבוע-זווית טיטניום הרוטור, עבור 1 h ו- 40 דקות ב 12 ° C, באמצעות המהירות המרבית של האצה והאטה. להוסיף בזהירות מחט בוטה מפלדת 40% או 60% iodixanol ממשק. לצרף את המחט מזרק 5 מ ל (איור 1E). האחות רק השבר ברורה, החלקיקים וקטור.הערה: לנפח הכללי שנאסף הוא כ 2.5-3 מ. הימנע האוסף של חומר מממשק 25-40%, מאז זה יהיה להגדיל את רמת ההידבקות באצוות וקטור הסופי, בשל נוכחותם של חלבונים שאינם רצויים. לעבד את השבר שנאספו (desalting וריכוז) או לאחסן אותו בן לילה ב 4 º C. איור 1: כיוונון עבור וקטור עוקבות אוסף וטיהור הדרגתיות iodixanol. (א) לפני pipetting iodixanol שונים מעברי הצבע לתוך הצינור ultracentrifugation, pipette אמצעי הולם של כל פתרון iodixanol לתוך צינור חרוטי נפרדים. פיפטה (B) ואז להשתמש פסטר להעביר באופן רציף כל פתרון iodixanol הצינור ultracentrifugation: שכבות של ריכוז גבוה יותר ויותר iodixanol אמור להתווסף בחלק התחתון של הצינור מתחת לשכבות קודמות. (ג) שכבה הווקטור גולמי lysate על גבי פעם מעבר הצבע הוכן. וקטור אוסף המערכת משתמשת מחטים חדים, מציג סיכון של פציעות ‘needlestick’. (ד) A-נירוסטה 316-מזרק המחט מוחדרת דרך מעבר הצבע iodixanol עד הממשק iodixanol 60% / 40%. וקטור (E) חלקיקים נמצאים בשלב iodixanol 40% והם נאספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 3. desalting וריכוז של וקטור AAV הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול לוקח כ 2 h. Prerinse קרום מסנן של צנטריפוגלי מסנן על-ידי הוספת 5 מ ל 1-PBS-ח”כ וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 4,000 גרם. הוסף 5 מ של 1 x PBS-ח”כ כדי השבר וקטור AAV שנאספו, לערבב ולאחר מכן להוסיף את הנפח הכולל המסנן. על תוספת של 1 x PBS-ח”כ, עכירות נצפית. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם עד האחסון הנוכחי מסנן בצורת חרוט הופחת ל 1 מ”ל. למחוק את הזרימה דרך שהצטברו בצינור אוסף החיצוני. להוסיף 13 מיליליטר 1 x PBS-ח”כ מסנן בצורת חרוט, חזור צנטריפוגה צעד כמה פעמים לפי הצורך (מינימום 3 x), עד שם הוא עכירות עוד לא ציין מתי טרי 1 x PBS-ח”כ נוסף. בגמר לשטוף צעד, להוסיף 13 מיליליטר PBS + 0.01% (v/v) ללא יונית חומרים פעילי שטח, צנטריפוגה ב x 4,000 גרם עד האחסון מופחתת ל- 300-350 µL. לאסוף את השבר הנותר נוכח מסנן על ידי pipetting אמצעי האחסון כולו לתוך צינור microcentrifuge הילך סטרילי.הערה: השבר הזה מכיל את הווקטור AAV desalted ומרוכז. בשלבים הבאים של פרוטוקול זה, שבר זו נחשבת השבר ‘ראשי’. כדי להתמודד עם הצינור מתחת למכסה המנוע ואחסן אותו ב 4 º C. לשטוף את המסנן עם µL 200 1 x PBS-ח”כ כדי לאסוף את החלקיקים וקטור לשארי נשמר מסנן. לאסוף צינור microcentrifuge סטרילי.הערה: זהו וקטור מדולל מניה, אשר עשוי להיות מתאים עבור יישומים מסוימים הדורשים התחתון וקטור titers. צעדים עתידיים, שבר זו נחשבת השבר “משניים”. לאחסון לטווח קצר, לאחסן את fraction(s) וקטור ב 4 ° C (פחות מ- 2 שבועות). Aliquot, חנות וקטור ב ‑20 ° C כאשר נדרש לאחסון לטווח ארוך. לבצע בקרת איכות כמתואר בסעיף 4. 4. טיטור של וקטור על ידי תגובת שרשרת פולימראזית כמותיים הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול אורכת כ-3 שעות. עיקול רגיל Linearize את transgene-ביטוי פלסמיד (pTransgene) משמש תרביות תאים תאים HEK-293T בסעיף 1. הכנת המיקס תקציר הגבלת צינור microcentrifuge 0.5 mL (עיין בטבלה 2 עבור ההרכב של המיקס תקציר הגבלה).הערה: התאם את ההרכב של המיקס תקציר הגבלה על פי האנזים המשמש את ההנחיות הקשורות מהיצרן. דגירה המיקס תקציר הגבלה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. בדוק היעילות של עיכול הגבלה על-ידי הפעלת את פלסמיד ליניארית ב- 0.8% (w/v) agarose ג’ל ב- 100 וולט לעיכול מלאה ח’ 1 פלסמיד צריך לייצר קטע אחד של גודל מוגדר. לטהר את פלסמיד ליניארי הדנ א באמצעות ערכת טיהור PCR, בעקבות ההוראות של היצרן24, ולמדוד את ריכוז הדנ א עם ספקטרופוטומטרים על ידי מדידת בליעת ב 260 ננומטר. לאחר טיטור, לאחסן את aliquot הנותרים של פלסמיד ליניארי-‑20 ° C לשימוש נוסף. לחשב את המולקולות (כלומר עותקים DNA) של המניה פלסמיד לכל microliter כדלקמן. ראשית, לחשב את המשקל המולקולרי של פלסמיד. בהנחה כי המשקל הממוצע של זוג בסיס DNA (bp) הוא 650 Daltons (Da) ושוקל את השומה אחת של bp 650 g, המשקל המולקולרי של כל תבנית ה-DNA גדילי כפול יכול להיות מוערך על ידי המכפלה של אורך (bp), משקל לכל זוג בסיסים.משקל מולקולרי פלסמיד [g/mol] = גודל פלסמיד [bp] x 650 [Da/bp] בשלב הבא, לחשב את מספר שומות של פלסמיד לכל microliter.שומות של פלסמיד לכל microliter = ריכוז פלסמיד [g/µL] / משקל מולקולרי פלסמיד [g/mol]הערה: ההופכי של משקל מולקולרי הוא המספר של שומות של פלסמיד נוכח 1g של החומר. לאחר מכן, לחשב את מספר מולקולות פלסמיד לכל microliter, באמצעות מספר אבוגדרו של (6.022 x 1023 מולקולות/שומה).מולקולות של פלסמיד לכל microliter = שומות של פלסמיד לכל microliter [שומות/µL] x מספר אבוגדרו [מולקולות/שומה] לבסוף, לדלל את המניה פלסמיד (מולקולות/µL) כדי לקבל פתרון µL 100 עם הריכוז הרצויה של עונה 1 פרק 109 מולקולות (וקטור הגנום (vg) לכל microliter).פלסמיד מניות (100 µL) = (הרצוי ריכוז [מולקולות/µL] x 100 µL) / מולקולות פלסמיד [מולקולות/µL] להפוך דילולים טורי של המניה פלסמיד (1 x 109 vg/µL) triplicates:µL 10 עונה 1 פרק 109 פלסמיד vg/µL מניות + 90 µL של H2O = פתרון vg/µL8 עונה 1 פרק 10µL 10 עונה 1 פרק 108 דילול vg/µL + µL 90 של H2O = פתרון vg/µL7 עונה 1 פרק 10µL 10 של דילול vg/µL7 עונה 1 פרק 10 + 90 µL של H2O = פתרון vg/µL6 עונה 1 פרק 10µL 10 עונה 1 פרק 106 דילול vg/µL + µL 90 של H2O = פתרון vg/µL5 עונה 1 פרק 10להמשיך לקבל פתרון vg/µL1 עונה 1 פרק 10. לשמור את דילולים טורי של המניה פלסמיד רגיל על הקרח עד מעמיסים אותם על הצלחת qPCR (סעיף 4.3). רכיב כמות 10 x מאגר אנזים הגבלה 5 ΜL אנזים הגבלה ΜL 2, 5 פלסמיד 5 µg H2O µL עד 50 טבלה 2: הגבלת תקציר מיקס ההרכב. טבלה 3: מחשבון נפח פלסמיד מניות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה. מן הווקטור AAV החילוץ דנ א לערבב 2 µL של AAV וקטור במלאי (השבר העיקרי מהשלב 3.5) עם µL 198 של DNase אני מאגר (1 x) רצועת צינורות (המבחנות) ולהוסיף 2 µL של DNase אני.הערה: DNase שלבזות את כל חומר גנטי שאינו נכלל בתוך capsid וקטור (אשר לעוות את התוצאות qPCR). פתרון זה נקרא דילול ‘dil1 x 10-2’. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות ב 95 ° C.הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור בנקודה זו, החומר ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן-4 ° C, כדי למנוע הידרדרות המוצר. להוסיף 2 µL של proteinase K הפתרון dil1 x 10-2 (שלב 4.2.1), תקופת דגירה של 60 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ואחריו 20 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.הערה: שלב זה לפרק את capsid וקטור AAV ונשחרר את הגנום וקטור AAV הפתרון. להוסיף proteinase K עודף החלבון (capsid) תוכן של המדגם אינו ידוע. שימו לב, זה חיוני כדי להבטיח כי כל פעילות proteinase K הוסר על ידי דנטורציה, לפני qPCR, כדי למנוע בעיות עם השפלה פולימראז (חלקית) המשפיעים על התוצאה הסופית. הכן 1:10 דילולים טורי של proteinase K שטופלו dil1 x 10-2 הפתרון (שלב 4.2.3) 1.5 mL microcentrifuge צינורות כדלקמן:10 µL dil1 x 10-2 + 90 µL של H2O = dil1 x 10-3 דילול10 µL dil1 x 10-3 + 90 µL של H2O = דילול dil1 x 10-4µL 10 of dil1 x 10-4 + µL 90 של H2O = dil1 x 10-5 דילול שמור את דילולים טורי של DNA שחולצו מן הווקטור על הקרח עד מעמיסים אותם על הצלחת qPCR (סעיף 4.3). טיטור מאת SYBR Green המבוסס על זיהוי qPCR היכונו המיקס מאסטר qPCR בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL, המדגם והן את הסטנדרטים. השתמש µL 10 של SYBR Green מאסטר מיקס, µL 1 של פריימר לפנים (המניות 10 מיקרומטר), µL 1 של פריימר הפוכה (10 מיקרומטר מניות) ו- 3 µL של H2O לכל תגובה. ראה הפרוטוקול בטבלה 4 עבור רצפי פריימר. Pipette את המיקס מאסטר qPCR למעלה ולמטה, אבל לא מערבולת. הוסף µL 15 של מיקס מאסטר qPCR, ואחריו גם µL 5 של העקומה סטנדרטי מוכן בסעיף 4.1 או ה-DNA שחולצו מן הווקטור AAV בסעיף 4.2, כל טוב. לכלול משלוש בארות המכיל רק את qPCR מאסטר מיקס, כפקד שלילי. עיין איור 2 עבור הפריסה צלחת. לאטום את הצלחת עם סרט איטום ו centrifuge בקצרה את הצלחת qPCR ב x 1,500 גרם ל 30 s-4 מעלות צלזיוס. להפעיל את תגובת qPCR מבוסס על הצלחת בזמן אמת PCR הגברה וזיהוי מכשיר, באמצעות התנאים הציע ב טבלה 5. פריימר שם רצף פריימר לפנים 5′-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3′ פריימר הפוכה 5′-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3′ טבלה 4: פריימר רצפים תוכנן כנגד האמרגן כקבוצת. איור 2: צלחת פריסה עבור טיטור וקטור מבוסס qPCR. הדגימות מסומנים בצבעים: ירוק = עיקול רגיל; כחול = H2O שליטה; גריי = שבר הראשי; כתום = שבר משני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. שלב זמן טמפרטורה מחזורים המטרה הדגירה קדם 5 דקות 95 ° C x1 DNA דנטורציה של פולימראז הפעלה (חם-start התגובה). הגברה 10 דקות 95 ° C x1 . שכפול ה-dna אולי ניתן למטב את הגדרות אם נעשה שימוש חלופי תחל עם טמפרטורות שונות מחזק. 10 s 95 ° C x40 40 s 60 ° C 1 s 72 ° C קירור 10 s 40 ° C x1 צלחת קירור. סוף PCR. טבלה 5: פרוטוקול אופניים תרמית עבור SYBR מבוסס-ירוק qPCR טיטור. ניתוח נתונים כדי לקבוע את AAV וקטור כייל נוגדנים למלא את התאים הנתונים בגיליון האלקטרוני (טבלה 6A) עם הערכים Ct השיג עבור דילולים שונים המדגם סטנדרטי מוכן בסעיף 4.1 ליצירת עיקול רגיל.הערה: המשוואה של העקומה הרגיל יוצג (y = ln (x) + b) יחד עם יעילות2 R(טבלה 6B). QPCR חייב להיות יעילות ל 100 אחוז ו- R2 קרוב 1.0 (≥ 0.96). השתמש את הערכים המחושבים של ו b כדי למלא אותם התאים הנתונים בגיליון האלקטרוני (טבלה 6C). להשלים את הגיליון האלקטרוני עם הערכים Ct השיג עבור דילולים שונים המדגם AAV המבושלות בסעיף 4.2. לחשב את ממוצע AAV וקטור כייל נוגדנים ב וקטור הגנום לכל microliter של ‘השבר הראשי’ על-ידי שימוש בנוסחה הבאה:הערה: הגורם 400 משמש הגנום נטושים יחיד, בעוד sc הגנום להשתמש פקטור הכפלה של 20025. . למעשה, כמויות ה-DNA כפול במהלך כל מחזור qPCR, sc-DNA הוא זיהה 2 x לעומת הגנום האס. אס. המטרה של טיטרציה היא לחשב את הריכוז מבחינת הגנום וקטור לכל microliter. תיקון הוא הכרחי עבור הפעלת את qPCR בעת שימוש µL 2 של הפעלת חומר (שלב 4.2.1). דיל מייצג את הגורמים לדילול מהשלב 4.2.4. ניתן לחשב את כייל של השבר וקטור AAV “משנית” (שלב 3.6) בו זמנית. טבלה 6: תבנית עבור ניתוח נתונים qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 5. טוהר שליטה על ידי עמודים מרחביות צביעת כסף הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול לוקח כ 5 שעות. השתמש אתנול 70% (v/v) לנקות ביסודיות את צלחות זכוכית המשמש ליציקת של ג’לים. להרכיב מערכת הליהוק ג’ל. ודא כי שהסוליות של הזכוכיות הם לא מרוסקת, כדי למנוע דליפה של תערובת אקרילאמיד בעת השלכת את הג’ל. להכין הערימה את הפתרונות ג’ל פתרון שני צינורות חרוט נפרד 50 מ. השמט את tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 10% (w/v) קירור (APS), כפי שהם אחראים פלמור של הג’ל. להוסיף אותם מיד לפני השלכת את הג’ל.הערה: האחוז הסופי של אקרילאמיד הג’ל השפעות לפרופיל ההפרדה של החלבונים: בדרך כלל, ריכוז 10% (v/v) הסופי של אקרילאמיד יהיה מספיק כדי לבדוק את טוהר הכנה וקטור AAV. מערבבים בעדינות על ידי מתערבל הצינור המכיל את הרכיבים ג’ל. לא מערבולת, מאז חמצון מוגזם עלול לפגום הפילמור. הוסף TEMED ו 10% (w/v) APS לפתרון ג’ל פתרון. לערבב, ואז שופכים לתוך המחזיק ג’ל עד שהוא מגיע 1-2 ס מ מתחת לקצה העליון של לוח הזכוכית הקטנה. מניחים שכבה של רווי מים butanol בראש התערובת אקרילאמיד. פעולה זו תבטיח את היווצרות של משטח שטוח בזמן הפילמור. אין להשאיר את הג’ל תחת אלכוהול יותר מ 30 דקות זה מייבשים את הג’ל, לפגום את תפקידה.התראה: Butanol. הוא דבר מסוכן במקרה של מגע עם העור הוא גם מציג סכנת שריפה. . לטפל. המתן הג’ל פולימריזציה ולאחר מכן יוצקים את butanol. עצה: בדוק אם לערבב ג’ל עודף בצינור התחזק. הפילמור מתרחש בתוך פחות מ 20 דקות לשטוף פני השטח של הג’ל עם H2O, ואז לייבש אותו בעזרת מגבות נייר, דואגת שלא להפריע את פני השטח של הג’ל. להוסיף TEMED ו 10% (w/v) APS לג’ל הערימה ויוצקים את הג’ל לתוך המחזיק ג’ל על הפרדת הג’ל. מקם את המסרק שסופקו הג’ל. בצע פעולה זו עם תנועה קבועה אחת כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בתוך הבארות. להמתין לפחות 20 דקות על הג’ל פולימריזציה. עצה: בדוק שאם מערבבים הג’ל עודף הצינור חרוט התחזק. להכין את תערובות שני (טבלה 7) עבור העיקרית והן את AAV משני וקטור שברים (צעדים 3.5, 3.6, בהתאמה). כמות גבוהה סכום נמוך צילומים של וקטור AAV 5 ΜL 1 ΜL 5 x דוגמת המאגר 3 ΜL 3 ΜL H2O 7 ΜL 11 ΜL טבלה 7: ההרכב של תערובות הדגימה הדרושים עבור צביעת כסף. מלא denature את תערובות לדוגמה על ידי חימום אותם עבור 5 דקות ב 95 ° C. להרכיב למיכל אלקטרופורזה, תשומת לב לכיוון האלקטרודה. למלא את המיכל 1 x מאגר הקתודה בתוך מכלול אלקטרודה ו- 1 x אנודת מאגר מבחוץ.הערה: מאגר אנודת ניתן למחזר מ לרוץ–לרוץ. עליך להשתמש תמיד מאגר קטודית טריים. להסיר הג’ל המסרק ונקה הבארות של הג’ל עם מאגר קטודית 1 x. לטעון µL 1 של הסולם חלבון בבאר. לטעון את תערובות מדגם בבארות שונים על הג’ל אותו (איור 3). להפעיל את הג’ל 50 V עד הדגימות להזין את הג’ל פתרון. אז תגביר את המתח ל-100 V עד לחזית לצבוע את הגבול התחתון של הג’ל מגיע. לחלץ את הג’ל בקפידה הזכוכיות, את הכסוף מכתים קיט (לפי הוראות היצרן26) כדי להמחיש את חלבונים ויראלי (VP1 VP2, VP3 subunits) המרכיבות את capsid AAV, כמו גם כדי לבדוק אם אפשרי חלבון זיהום (איור 3). איור 3: הערכה של טוהר וקטוריות באמצעות מרחביות-דף וצביעת כסף- באמצעות ג’ל Tricine-מרחביות, 5 µL של ההכנות וקטור השונים הופרדו. חלבונים אותרו לאחר מכן על ידי צביעת כסף. וקטורים נחשבים טהור כאשר VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa), ו- VP3 (60 kDa) גלויים ב- 1:1: יחס 10 (ליין 1), ללא רקע מוגזמת (ליין 2) או שאינם ספציפיים להקות (ליין 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.