רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

הערה: פרוטוקול NLR-seq מורכב משלושה שלבים עוקבים: 1) הפקת גבוהה-מולקולרית משקל DNA גנומי (HMW); 2) ארוכים במיוחד בניה ספריית דנ א, הכוללת פרגמנטציה של ה-DNA HMW לתוך הגדלים הרצויים, מצדו של מתאמי רצף ה-DNA מסתיימת; ו 3) טעינת ה-dna ובין אם-לא מתאם אל מערכי nanopores (איור 1). 1. HMW DNA החילוץ ריאגנט כיוונון. להפוך 1 x פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS) מאגר (1,000 מ ל) על-ידי הוספת 100 מ של PBS (10 x) עד 900 מ”ל של מים, לערבב היטב. לבצע פירוק מאגר (50 מ”ל) על-ידי הוספת 43.5 מ ל מים צינור 50 מ. להוסיף 500 μL של טריס (1 מ’, pH 8.0), 1 מ”ל של נתרן כלורי (NaCl) (5 מ’), 2.5 מ ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.5 M, pH 8.0), 2.5 מ של dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) (10%, wt/כרך) אל הצינור ומערבבים היטב.הערה: מאגר PBS שניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. ניתן לאחסן את המאגר פירוק premade ב RT עד 2 חודשים. בדוק את התמותה תא ולספור את התאים. ודא היחס לחיות הוא > 85% מספר התאים הכולל הוא 30 x 106.הערה: התאים המשמשים פרוטוקול זה הם משורת תא HG00733, קו תא lymphoblastoid אדם ממוצא פורטוריקני בשימוש נרחב האיחוד הגנום 1000 לניתוח וריאציה מבניים (ראה טבלה של חומרים עבור הרכישה), אשר שייך למשאב מדגם הגנום בינלאומיים. לאסוף את התאים על ידי צריך שתוציאו ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך המדיום, resuspend בגדר תא (30 x 106 תאים) עם 5 מ ל 1 x PBS המאגר. צנטריפוגה שוב ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.הערה: 25-35 x 106 תאים מקובלים על גישה זו. עוד וריאציה של תאים בשימוש יהיה עליך עוד יותר אופטימיזציה. ניתן לאחסן בגדר תא-−80 ° C עד 6 חודשים. Resuspend בגדר תא בμl 200 1 x PBS המאגר. אם משתמש גלולה תא קפוא, לשטוף עם 5 מ ל 1 x PBS המאגר. Centrifuge הפתרון ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב RT, למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי μL 200 1 x מאגר PBS. הכינו 10 מ”ל פירוק המאגר בצינור 50 מ. להוסיף התליה תא 200 μL פירוק מאגר ו מערבולת במהירות הגבוהה ביותר עבור Incubate ס’ 3 הפתרון ב 37 ° C עבור 1 h. להוסיף 2 μL של RNase A (100 מ”ג/מ”ל) lysate. סובב בעדינות את הצינור 50 מ לערבב את הדגימה. דגירה הפתרון ב 37 ° C עבור 1 h. להוסיף μL 50 proteinase K (20 מ”ג/מ”ל) lysate. סובב בעדינות את הצינור 50 מ לערבב את הדגימה. דגירה הפתרון ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. במהלך הדגירה, בעדינות לערבב המדגם בכל 30 דקות. הסר את הצינור 50 מ של 50 ° C ומשהים ב RT 5 דקות. להוסיף 10 מ של השכבה פנול של אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl (25:24:1, כרך/כרך/כרך) lysate, לסובב את הצינורית על מערבל מסובב (ראה טבלה של חומרים) ב RT בשכונה fume ב rpm 20 במשך 10 דקות לעטוף את הצינורית עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע דליפה במהלך הסיבוב. להכין שני צינורות 50 מ ל ג’ל (ראה טבלה של חומרים) על-ידי צריך שתוציאו ב x 1,500 g למשך 2 דקות ב- RT.הערה: הג’ל יוצר מחסום יציב בין השלב מימית המכילה חומצות גרעין הממס האורגני. שופכים הפתרון מדגם/פנול לתוך אחד מוכן 50 מ ל ג’ל צינורות. שלב 1.10. Centrifuge הפתרון ב x 3000 g 10 דקות ב- RT. שופכים את תגובת שיקוע לתוך צינור 50 מ. להוסיף 10 מ של השכבה פנול של אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl (25:24:1, כרך/כרך/כרך) ולסובב את הצינורית על מערבל מסובב ב RT בשכונה fume ב 20 rpm למשך 10 דקות. חזור על שלב 1.11 פעם אחת עם השנייה מוכן שפופרת ג’ל. שופכים את תגובת שיקוע לתוך צינור 50 מ. להוסיף 25 מ של אתנול 100% קר כקרח, סובב בעדינות את הצינורית ביד עד ה-DNA ארגונייט שוקע (איור 2).הערה: הגישה משקעים מסייע לייצב את הדנ א HMW. כיפוף טיפ 20 μL כדי להפוך קרס. בזהירות להוציא את ה-DNA HMW עם הקרס, שחררו את המסירה נוזלי. המקום ה-DNA HMW לתוך צינור 50 מ ל המכיל 40 מ”ל אתנול 70%. לשטוף את ה-DNA על-ידי היפוך בעדינות את הצינור 3 פעמים. חזור על שלב 1.15 פעם לאסוף DNA מהצינור 70% אתנול. המקום ה-DNA HMW לתוך צינור 2 מ”ל המכיל מ 1.8 ל-70% אתנול. Centrifuge ה-DNA HMW שטף ב x 10,000 g 3 s ב RT. הסר כמות האתנול שיורית ככל האפשר על-ידי pipetting.הערה: נא לא להפריע בגדר DNA כאשר pipetting האתנול שיורית. דגירה הצינור 2 מ”ל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם מכסה פתוח כדי לייבש את הדגימה. אם ממשיכים עם 2.1 (עם הטיית מכני ו 1 ערכת עריכה ברצף של מצדו D), להוסיף 1 מ”ל של TE (10 מ מ EDTA טריס ו- 1 מ מ, pH 8.0) הצינור 2 מ”ל. אם ממשיכים עם 2.2 שלב (עם רסס מבוססי transposase, ערכת רצף מהיר), הוסף 200 μL 10 מ מ טריס (pH 8.0) 0.02% טריטון X-100.הערה: נא לא להפריע בגדר ה-DNA. נותן את הצינור עמוד 4 ° C בחושך במשך 48 שעות יעזור המדגם באופן מלא resuspend. ניתן לאחסן את הדנ א HMW ב 4 ° C עד 2 שבועות. זמן אחסון רב יותר או תנאים אחסון אחרים עשויים להציג קטעים קצרים יותר. 2. ארוכים במיוחד הבנייה ספריית דנ א הערה: יש שתי דרכים כדי לבנות את ספריות DNA ארוכים במיוחד מבוסס על שתי שיטות ההטיה שונות בשילוב עם ערכות רצף nanopore. ספריה מבוסס על חיתוך מכני מפיק נתונים עם N50 של 50-70 kb, לוקח בערך 8 שעות להקמת ספריה. ספרייה המבוססת על פיצול transposase מייצרת של N50 של 90-100 kb נתונים, לוקח רק 90 דקות להקמת ספריה. פרוטוקול חיתוך מכני נותן תשואה גבוהה יותר מ דנ א קלט זהה בגירסאות של רצף מתאם ואיכות של תאים זרימה nanopore. בניית ספריה מבוסס על חיתוך מכני הפשרה, תערובת ריאגנטים מ מצדו קיט (ראה טבלה של חומרים). הפשרה FFPE DNA תיקון מאגר, סוף מאגר תיקון/דה-עוקב על קרח, ואז המערבולת ו ספין למטה כדי לערבב. הפשרת מתאם שילוב (AMX) ומאגר מתאם חרוז מחייב (ABB) על קרח, ואז פיפטה ו ספין למטה כדי לערבב. הפשרה פועל מאגר עם תערובת דלק (RBF) ו • תנאי מאגר (ELB)-RT, ואז מערבולת ספין כדי לערבב. הפשרת ספריית טעינת חרוזים (LLB) RT, פיפטה לערבב לפני השימוש. ברגע הקרת, לשמור על כל הרכיבים קיט על קרח. להוציא את אנזימי רק בעת הצורך. להביא את החרוזים מגנטי RT לשימוש.הערה: לקבלת המלצות על החרוזים מגנטיים לשימוש ראה את הטבלה של חומרים. בדוק את האיכות והכמות של ה-DNA HMW מהשלב 1.21.1. פיפטה החוצה 20 μL של ה-DNA לתוך צינורות חדשים 1.5 mL ממקומות שונים שלושה בצינור HMW DNA באמצעות P200 רחב נשא טיפים. קח μL 1 מ aliquots שלושה כדי לזהות את הריכוז באמצעות fluorometer ואת איכות באמצעות אולטרה קריאה. בדוק מספר פעמים כדי לאשר את התוצאות.הערה: התוצאות הצפויות מוצגים באיור 3 א. הערך260/280 OD הוא כ 1.9 והוא הערך260/230 OD כ 2.3. העברת μL 940 הנותרים של ה-DNA HMW לתוך כובע שפופרת 50 מ עם P1000 רחב נשא עצה. תשאף כל DNA לתוך מזרק 1 מ”ל ללא המחט. לשים את המחט 27 G על גבי המזרק והוצא כל DNA לתוך הכיפה ובאיטיות (~ 10 s). . תוריד את המחט 27 G מן המזרק חזור על הצעדים 2.1.4 ו 2.1.5 29 פעמים עבור סכום כולל של 30 עובר דרך המחט.הערה: ה-DNA הוטו HMW ניתן לאחסן ב 4 ° C בחושך עד ה 24 בקרת איכות (QC) מומלץ בחום על ידי אלקטרופורזה בג’ל פעמו-שדה, אבל זה יקר ומבזבז זמן. אם מבצע QC במחשב הדופק אוטומטית שדה ג’ל אלקטרופורזה להשתמש בפרוטוקול 5-150 kb עבור ה 20 לרוץ. התוצאות הצפויות מוצגים באיור4. הכנת התגובה תיקון ה-DNA בשפופרת 0.2 מ”ל על-ידי הוספת μL 100 של DNA HMW הוטו (20 μg), μL 15 FFPE DNA תיקון מאגר μL 12 של מיקס תיקון ה-DNA FFPE, 16 μL של נוקלאז ללא מים. לערבב את התגובה על ידי מצליף בעדינות 6 פעמים, ספין למטה כדי להסיר בועות. דגירה התגובה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 60 דק העברה המדגם לתוך צינור 1.5 mL החדש עם טיפ P200 נשא רחב. Resuspend את החרוזים מגנטי pipetting או vortexing. הוסף μL 143 חרוזים (1 x) התגובה תיקון ה-DNA, לערבב בעדינות על ידי מצליף הצינור 6 פעמים. לסובב את הצינורית על מערבל מסובב ב RT-סל ד 20 למשך 30 דקות. בדוגמה ב x 1000 g 2 s במקום RT. הצינורית על מתלה מגנטי במשך 10 דקות לשמור את הצינורית על מתלה מגנטי ולמחוק את תגובת שיקוע. שמירה על הצינור על מתלה מגנטי, להוסיף μL 400 של אתנול 70% שזה עתה הוכנו מבלי להפריע בגדר. להסיר את אתנול 70% לאחר 30 s. חזור על שלב 2.1.11 פעם אחת. בדוגמה ב x 1000 g 2 s במקום RT. הצינור בחזרה על המדף מגנטי. להסיר כל אתנול שיורית, אוויר יבש ב-30 s. לא מעל יבשה בגדר. להסיר את הצינור מהמדף מגנטי ולהוסיף μL 103 של TE (10 מ מ EDTA טריס ו- 1 מ מ, pH 8.0). בעדינות פליק צינור כדי להבטיח כי חרוזים מכוסים המאגר, דגירה על מערבל מסובב ב RT במשך 30 דקות בעדינות קפיצי הצינור כל 5 דקות כדי לסייע resuspension של בגדר. גלולה החרוזים על מתלה מגנטי במשך לפחות 10 דקות להעביר 100 μL של eluate עם P200 רחב נשא עצה לתוך צינור 0.2 מ”ל. הכנת התגובה דה-עוקב בשפופרת 0.2 מ”ל ותיקון קצה על-ידי הוספת μL 100 של לתיקון DNA HMW, 14 μL סוף תיקון/דה-עוקב מאגר, 7 μL של סוף תיקון/דה-עוקב מיקס. לערבב את התגובה על ידי מצליף בעדינות 6 פעמים, ספין למטה כדי להסיר בועות. דגירה התגובה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ולאחריו 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ולאחר מכן החזק-22 מעלות צלזיוס. העברת הדגימה לתוך צינור 1.5 mL החדש באמצעות P200 רחב נשא עצה. Resuspend את החרוזים מגנטי pipetting או vortexing. להוסיף μL 48 של חרוזים (0.4 x) סוף תיקון/דה-עוקב התגובה, לערבב בעדינות על ידי מצליף הצינור 6 פעמים. לסובב את הצינורית על מערבל מסובב ב RT-סל ד 20 למשך 30 דקות. חזור על צעדים 2.1.10-2.1.13 פעם. להסיר את הצינור מהמדף מגנטי ולהוסיף μL 33 של TE (10 מ מ EDTA טריס ו- 1 מ מ, pH 8.0). בעדינות פליק צינור כדי להבטיח כי חרוזים מכוסים המאגר, דגירה על מערבל מסובב ב RT במשך 30 דקות בעדינות קפיצי הצינור כל 5 דקות כדי לסייע resuspension של בגדר. גלולה החרוזים על מתלה מגנטי במשך לפחות 10 דקות להעביר 30 μL של eluate עם P200 רחב נשא עצה לתוך צינור 1.5 mL החדש. . קח את μL עוד 1-2 כדי לזהות את הריכוז באמצעות fluorometerהערה: שחזור של 5-6 μg בשלב זה צפוי. להכין את התגובה מצדו בצינור מדגם 1.5 mL על-ידי הוספת μL 30 של סוף לתיקון DNA HMW, μL 20 של מתאם שילוב (AMX 1 י), μL 50 של בלאנט/ת א מצדו מיקס מאסטר. מערבבים את התגובה על ידי מצליף בעדינות 6 פעמים בין כל תוספת רציפים ו ספין למטה כדי להסיר בועות. דגירה התגובה ב RT עבור 60 דקות. Resuspend את החרוזים מגנטי pipetting או vortexing. להוסיף 40 חרוזים μL (0.4 x) מצדו תגובה, לערבב בעדינות על ידי מצליף הצינור 6 פעמים. לסובב את הצינורית על מערבל מסובב ב RT-סל ד 20 למשך 30 דקות. חזור על שלב 2.1.10 פעם אחת. להוסיף 400 μL מתאם חרוז מחייב (ABB) מאגר לתוך הצינור. קפיצי הצינור בעדינות 6 פעמים כדי resuspend את החרוזים. מקם את הצינור בחזרה על המדף מגנטי כדי להפריד את החרוזים מתוך המאגר ולמחוק תגובת שיקוע. חזור על שלב 2.1.26 פעם. בדוגמה ב x 1000 g 2 s במקום RT. הצינור בחזרה על המדף מגנטי. להסיר את כל מאגר שיורית, אוויר יבש ב-30 s. לא מעל יבשה בגדר. הסר את הצינור מהמדף מגנטי, resuspend בגדר ב μL 43 • תנאי המאגר. בעדינות פליק צינור כדי להבטיח חרוזים מכוסים המאגר דגירה על מערבל מסובב ב RT במשך 30 דקות בעדינות קפיצי הצינור כל 5 דקות כדי לסייע resuspension של בגדר. גלולה החרוזים על מתלה מגנטי במשך לפחות 10 דקות להעביר 40 μL של eluate עם P200 רחב נשא עצה לתוך צינור 1.5 mL החדש. . קח את μL עוד 1-2 כדי לזהות את הריכוז באמצעות fluorometerהערה: שחזור של 1-2 μg בשלב זה צפוי. הספרייה מבוססת על הטיית מכני מוכן להעלאה. ניתן לאחסן בספריה על קרח עבור עד 2 שעות עד טעינה עבור רצף במידת הצורך. בניין הספרייה מבוססת-פיצול Transposase הפשרה ריאגנטים מ transposase קיט (ראה טבלה של חומרים). הפשרת פיצול מיקס (FRA), מתאם מהירה (ראפ) על קרח, פיפטה לערבב. הפשרת רצף מאגר (SQB), טוען חרוזים (LB), ריקון מאגר (FLB) ריקון הקשר (טיסה)-RT, פיפטה לערבב. הפשרת הטעינה חרוזים (LB) RT, פיפטה לערבב לפני השימוש. ברגע הקרת, לשמור על כל הרכיבים קיט על קרח. להוציא את אנזימי רק בעת הצורך. בדוק את האיכות והכמות של ה-DNA HMW מהשלב 1.21.2. פיפטה החוצה 20 μL של ה-DNA לתוך צינורות חדשים 1.5 mL ממקומות שונים שלושה בצינור HMW DNA באמצעות P200 רחב נשא טיפים. קח μL 1 מ aliquots שלושה כדי לזהות את הריכוז באמצעות fluorometer ואת איכות באמצעות אולטרה קריאה. בדוק מספר פעמים כדי לאשר את התוצאות.הערה: התוצאות הצפויות מוצגים באיור 3B. הערך260/280 OD הוא כ 1.9 והוא הערך260/230 OD כ 2.3. הכינו את התגובה tagmentation DNA בשפופרת 0.2 מ”ל על-ידי הוספת μL 22 של DNA HMW, 1 μL 10 מ מ טריס (pH 8.0) עם 0.02% טריטון μL X-100 ו- 1 של פיצול לערבב (FRA). מיקס על ידי pipetting עם P200 רחב נשא עצה לאט ככל האפשר 6 פעמים, מטפל לא להכיר בועות. דגירה התגובה ב 30 ° C עבור 1 דקות ולאחריה 80 ° C עבור 1 דקות ולאחר מכן החזק ב 4 º C. להעביר התערובת לתוך צינור 1.5 mL החדש עם P200 רחב נשא עצה ועבור אל הצעד הבא מיד. להוסיף 1 μL של מתאם מהירה (ראפ) הצינור מדגם 1.5 mL. מיקס על ידי pipetting עם P200 רחב נשא עצה לאט ככל האפשר 6 פעמים, מטפל לא להכיר בועות. דגירה התגובה ב RT עבור 60 דקות.הערה: הספרייה מבוססת-פיצול transposase מוכן להעלאה. ניתן לאחסן בספריה על קרח עבור עד 2 שעות עד טעינה עבור רצף במידת הצורך. 3. קביעת רצף על המכשיר nanopore בדוק את ההתקן רצף nanopore (ראה טבלה של חומרים). ודא כי התוכנה והחומרה פועלים וגם די שטח אחסון. בדוק את התא זרימה. לפתוח תא זרם חדש והכנס את התא זרימה לתוך המכשיר nanopore. בדוק שבתיבת מיקום התא זרימה הוכנס (X1-X5). בחר את סוג התא זרימה נכונה. לחץ על בדוק תאים זרימה זרימת העבודה. לחץ על הלחצן Test להתחיל להפעיל את התא זרימה QC ניתוח.הערה: אם המספר שדווח נקבובית פעיל הכולל פחות מ 800, השתמש תא זרימה שונים חדש עבור רצף. הכנת המאגר לקרקע. עבור ספריית מבוסס על חיתוך מכני, להוסיף μL 576 של הפעלת מאגר עם תערובת דלק (RBF) ו- 624 μL של נוקלאז ללא מים לתוך צינור 1.5 מ ל. מערבולת, ספין למטה כדי לערבב החומר הממתן לקרקע. עבור ספריית transposase המבוסס על פיצול, להוסיף 30 μL של הקשר סומק (FLT) הצינור מאגר סומק (FLB). מערבולת, ספין למטה כדי לערבב החומר הממתן לקרקע. על התא זרימה, להעביר את המכסה לקרקע בכיוון השעון, כדי לחשוף את היציאה לקרקע. מוגדר על פיפטה P1000 100 μL והכנס את הקצה ליציאת ה-לקרקע. לסגת נפח קטן של מאגר (פחות מ- 30 μL) כדי להסיר את כל הבועות מהתא זרימה. להפסיק pipetting פעם כמות קטנה של נוזל צהוב מזין את הטיפ. השתמש פיפטה P1000 כדי לטעון μL 800 של המיקס לקרקע לתוך התא זרימה דרך הנמל לקרקע. כדי להימנע היכרות עם בועות, להוסיף 30 μL של המיקס לקרקע כדי לכסות את החלק העליון של הנמל לקרקע קודם, ואז להוסיף את הטיפ ליציאת ה-לקרקע ולהוסיף לאט שאר המיקס לקרקע. להוציא את הטיפ כאשר יש כ-50 μL משמאל. מוסיפים את שארית תערובת לקרקע בראש הנמל לקרקע. הנוזל יעבור בתוך עצמו. להשאיר את ההתקנה עד תקופת דגירה של 5 דקות. בינתיים, הכנת המיקס ספריית בצינור 1.5 mL המכיל את הספרייה.הערה: עבור ספריית מבוסס על חיתוך מכני להוסיף µL 35 של הפעלת מאגר עם תערובת דלק (RBF) כדי µL 40 של ספריית ה-DNA. עבור ספריית המבוסס על פיצול transposase להוסיף µL 34 רצף מאגר (SQB) ו-16 µL של מים נטולי נוקלאז µL 25 של ספריית ה-DNA. פתח את המכסה יציאת זרימה מדגם תא בעדינות כדי לחשוף את היציאה מדגם. השתמש פיפטה P1000 כדי להוסיף 200 μL של המיקס לקרקע באמצעות היציאה לקרקע לתוך התא זרימה כפי שמתואר בשלב 3.5. ודא כי השילוב לקרקע אינו נטען לתוך התא זרימה דרך היציאה הדגימה. הגדר של פיפטה P200 80 μL. מערבבים הספרייה בעדינות עם טיפ נשא רחב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 6 פעמים בדיוק לפני הטעינה. לטעון את התמהיל ספריית dropwise דרך היציאה מדגם לתוך התא זרימה. הוסף כל ירידה רק לאחר ההעברה הקודמת היא טעינתו היציאה. להחזיר את המכסה מדגם בעדינות ולוודא שיציאת מדגם מכוסה. הזז את המכסה לקרקע התרחקותו כדי לכסות את היציאה לקרקע. . סגור את המכסה התקן לחץ על זרימת העבודה התנסות חדשה . הקלד את שם הספריה, בחר ערכת הנכונה על פי הנהלים הנהוגים ולאחר לבדוק שההגדרות הן נכונות (48 h לרוץ, על בסיס שיחות בזמן אמת). לחץ על התחל הפעלה. לאחר 10 דקות, הקלט המזהה את התא זרימה, המספרים nanopore פעיל (סה כ ומספרים כל ארבע קבוצות) מן המידע לרוץ. ניתוח נתונים. העתק את נתוני מחשב מקומי או אשכול בכל עת רצף או בסיום המרוץ. להשתמש Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) כדי ליישר את הנתונים רצף הגנום הפניה. מסכמים את הביצועים רצף הנתונים הגולמיים רצף, במערכים את לפי NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).