प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण
Summary
यहाँ हम एक सामान्य पल्स-चेस विधि है कि तह, परिवहन के काइनेटिक विश्लेषण की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, और प्रोटीन की गिरावट जीवित कोशिकाओं में पालन किया जाना है ।
Abstract
रेडियोधर्मी पल्स-चेस लेबलिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो अपने कार्यात्मक सेलुलर स्थान के लिए परिवहन, और जीवित कोशिकाओं में लक्ष्य प्रोटीन की गिरावट का अध्ययन करने के लिए । लघु (पल्स) radiolabeling बार (< 30 मिनट) और कसकर नियंत्रित चेस बार का उपयोग करके, यह कुल प्रोटीन पूल का केवल एक छोटा सा अंश लेबल और इसके तह का पालन करने के लिए संभव है । जब एसडीएस-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) और immunoprecipitation के साथ (अनुरूपण-विशिष्ट) एंटीबॉडी को कम करने के साथ संयुक्त, तह प्रक्रियाओं महान विस्तार में जांच की जा सकती है । इस प्रणाली में घुलनशील प्रोटीन, एकल और बहु-पास transmembrane प्रोटीन, भारी एन और ओ-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, और प्रोटीन के साथ और व्यापक डाइसल्फ़ाइड के बिना गुणों में एक विशाल भिन्नता के साथ प्रोटीन की तह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है संबंध. पल्स-चेस तरीकों अतिरिक्त सुविधाओं की एक सीमा में काइनेटिक अध्ययन के आधार हैं, सह और posttranslational संशोधनों, oligomerization, और बहुलकीकरण सहित, अनिवार्य रूप से जंम से मृत्यु तक एक प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति । नाड़ी-चेस प्रोटीन तह पर अध्ययन वृद्धि हुई लौकिक संकल्प और शारीरिक जानकारी प्रदान करके इन विट्रो में प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अंय जैव रासायनिक और भौतिक तरीकों के साथ पूरक हैं । इस समाचार पत्र के भीतर वर्णित तरीकों को आसानी से अनुकूलित कर रहे है लगभग किसी भी प्रोटीन है कि स्तनधारी या कीट-कोशिका प्रणालियों में व्यक्त किया जा सकता है की तह का अध्ययन ।
Introduction
यहां तक कि अपेक्षाकृत सरल प्रोटीन की तह कई अलग तह एंजाइमों, आणविक chaperones, और आबंध संशोधनों1शामिल है । इन विट्रो में प्रक्रियाओं का एक पूरा पुनर्गठन व्यावहारिक रूप से असंभव है, शामिल विभिंन घटकों की विशाल संख्या दी । यह अत्यधिक वांछनीय है, इसलिए, vivo मेंप्रोटीन तह अध्ययन करने के लिए, जीवित कोशिकाओं में । रेडियोधर्मी पल्स-चेस तकनीक संश्लेषण, तह, परिवहन, और उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन के क्षरण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित ।
३५S-लेबल methionine/cysteine के साथ एक छोटी नाड़ी के दौरान प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग, एक रेडियोधर्मी लेबल के अभाव में एक पीछा द्वारा पीछा किया, व्यापक सेलुलर वातावरण में नव संश्लेषित प्रोटीन की आबादी के विशिष्ट ट्रैकिंग की अनुमति देता है । फिर, लक्ष्य प्रोटीन immunoprecipitation के माध्यम से अलग किया जा सकता है और एसडीएस के माध्यम से विश्लेषण-पृष्ठ या अंय तकनीकों । कई प्रोटीन के लिए, सेल के माध्यम से उनकी यात्रा एसडीएस-पृष्ठ जेल पर दिखाई दे रहे हैं कि संशोधनों के द्वारा चिह्नित है । उदाहरण के लिए, endoplasmic जालिका (ईआर) से Golgi परिसर में ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का परिवहन अक्सर N-लिंक्ड glycans के संशोधनों के साथ होता है या ओ-लिंक्ड glycans2,3के अलावा । इन संशोधनों के कारण स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में बड़ी वृद्धि होती है, जो एसडीएस में गतिशीलता परिवर्तन द्वारा देखा जा सकता है-पृष्ठ. परिपक्वता भी proteolytic दरारें द्वारा चिह्नित किया जा सकता है, जैसे सिग्नल पेप्टाइड दरार या समर्थक के हटाने पेप्टाइड्स, स्पष्ट आणविक द्रव्यमान है कि आसानी से एसडीएस पर पीछा किया जा सकता में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप-पृष्ठ जेल4. रेडियोधर्मिता जैसे cycloheximide चेस, जहां उपंयास प्रोटीन संश्लेषण रोका जाता है के रूप में तुलनीय तकनीक पर काफी लाभ है, के रूप में अब उपचार कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे है और पुराने के बहुमत से बाहर नहीं है, स्थिर राज्य प्रोटीन से विश्लेषण, के रूप में कुछ प्रोटीन है आधा दिनों की रहती है । दोनों और कम करने की स्थिति के तहत प्रोटीन की तुलना डाइसल्फ़ाइड बांड गठन के विश्लेषण की अनुमति देता है, कई स्रावी प्रोटीन की तह में एक महत्वपूर्ण कदम4,5,6, 7.
यहां हम प्रोटीन तह और बरकरार कोशिकाओं में परिवहन के विश्लेषण के लिए एक सामांय विधि का वर्णन, एक रेडियोधर्मी पल्स-चेस दृष्टिकोण का उपयोग कर । जब तक हम के रूप में संभव के रूप में विस्तृत विधि प्रदान करने का उद्देश्य है, प्रोटोकॉल अनुकूलन क्षमता के लिए एक लगभग असीम संभावना है और अनुकूलन प्रत्येक पाठक विशिष्ट प्रोटीन का अध्ययन करने की अनुमति होगी ।
दो वैकल्पिक पल्स चेस प्रोटोकॉल, अनुयाई कोशिकाओं के लिए एक (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के चरण १.१) और निलंबन कोशिकाओं के लिए एक (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के चरण १.२) प्रदान की जाती हैं । यहां उपलब्ध कराई गई शर्तों को उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के माध्यम से व्यक्त एक प्रोटीन कल्पना करने के लिए पर्याप्त हैं । यदि पाठक खराब व्यक्त प्रोटीन या विभिन्न posttreatment स्थितियों, जैसे कई immunoprecipitations के साथ काम कर रहा है, यह उचित रूप से पकवान आकार या सेल संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है ।
निलंबन पल्स चेस के लिए, हर समय बिंदु पर लिया चेस नमूने सभी कोशिकाओं की एक ट्यूब से लिया जाता है । नाड़ी के बाद धो चरण छोड़ दिए जाते हैं; इसके बजाय, ३५एस के आगे निगमन unlabel्ड methionine और cysteine की एक उच्च अतिरिक्त के साथ कमजोर पड़ने से रोका जाता है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेडियोधर्मी ३५एस का उपयोग करें-लेबल cysteine और methionine सेलुलर प्रोटीन तह प्रक्रियाओं का पालन करें । रेडियोधर्मी एजेंट के साथ सभी आपरेशनों के ऑपरेटर और रेडियोधर्मी विकिरण के लिए पर्यावरण के किसी भी जोखिम को कम करने और एक नामित प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने के लिए उपयुक्त सुरक्षात्मक उपायों का उपयोग किया जाना चाहिए । पल्स-चेस लेबलिंग तकनीक के रूप में कम पल्स बार में अपेक्षाकृत अक्षम है (< 15 मिनट), रेडियोधर्मिता के प्रारंभिक राशि के कम से 1% नव संश्लेषित प्रोटीन में शामिल किया गया है. immunoprecipitation के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के संवर्धन के बाद, एसडीएस के लिए नमूना पृष्ठ रेडियोधर्मिता की प्रारंभिक राशि के कम से ०.०५% होता है ।
हालांकि ३५एस methionine और cysteine लेबलिंग मिश्रण स्थिर है, कुछ अपघटन, अस्थिर रेडियोधर्मी यौगिकों उपज, हो जाएगा । शोधकर्ता और तंत्र की रक्षा के लिए कुछ सावधानियां बरती जानी चाहिए । शोधकर्ता हमेशा स्थानीय विकिरण सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए और एक प्रयोगशाला कोट और (डबल) दस्ताने के अलावा एक चारकोल नर्सिंग मास्क, पहन सकते हैं । ३५एस methionine और cysteine के साथ शेयर शीशियों हमेशा एक धुएं डाकू में खोला जाना चाहिए, या एक स्थानीय आकांक्षा बिंदु के तहत । ज्ञात प्रयोगशाला प्रदूषित धब्बे केंद्रापसारक, पिपेट, पानी स्नान, मशीन, और शेखर हैं । इन क्षेत्रों के संदूषण एक लकड़ी का कोयला फिल्टर के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग करके कम है, सकारात्मक मुहर microcentrifuge ट्यूबों ( सामग्री की तालिकादेखें), पानी स्नान में मछलीघर लकड़ी का कोयला स्पंज, चारकोल फिल्टर कागज नाड़ी में चिपके-चेस व्यंजन, आकांक्षा प्रणाली में लकड़ी का कोयला गार्ड, और बर्तन और मशीन और भंडारण कंटेनरों में लकड़ी का कोयला युक्त अनाज की नियुक्ति ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पल्स-चेस विधियों बरकरार कोशिकाओं में प्रोटीन तह के वैज्ञानिकों की समझ विकसित करने के लिए आवश्यक हो गया है । जब तक हम एक तरीका है कि संभव के रूप में सामांय है प्रदान करने का प्रयास किया है, इस दृष्टिकोण लग…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Braakman लैब, अतीत और वर्तमान के सभी सदस्यों को धंयवाद, उनके उपयोगी विचार विमर्श के लिए और इस लेख में प्रस्तुत तरीकों के विकास में मदद करते हैं । इस परियोजना को यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम (FP7/2007-2013) एन ° २३५६४९ और नीदरलैंड संगठन के वैज्ञानिक अनुसंधान (NWO) के तहत दोनों यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है इको-प्रोग्राम N ° 711.012.008 के अंतर्गत ।
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Referenzen
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