이 프로토콜의 목표는 포함 하는 설탕 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 애기 thaliana 묘 cotyledons 클러스터 stomata를 유도 하는 방법 및 엽록체와 같은 세포내 구조를 관찰 하는 방법 그리고 confocal를 사용 하 여 클러스터 된 가드 셀에 microtubules 레이저 현미경 검사 법.
Stomatal 운동 중재 공장 가스 교환, 광합성과 증발을 위해 필수적 이다. Stomatal 열고 닫는 중요 한 증가 의해 달성 되 고 각각 가드 셀 볼륨 감소. 때문에 이온과 물의 셔틀 수송 가드 셀과 큰 이웃 상피 세포 간의 stomatal 운동 하는 동안, 식물 stomata의 간격된 분포 stomatal 움직임을 위해 최적의 배포를 간주 됩니다. Stomata의 간격된 패턴 perturbing에 대 한 실험 시스템은 간격 패턴의 의미를 검사 하는 데 유용 합니다. 간격된 stomatal 배포와 관련 된 몇 가지 핵심 유전자 확인 되었습니다, 그리고 클러스터 stomata를 실험적으로이 유전자를 변경 하 여 유도 될 수 있다. 또는 클러스터 stomata 또한 유전 수정 없이 exogenous 치료에 의해 유도 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 클러스터 stomata 애기 thaliana 묘 목에 대 한 간단한 유도 시스템을 설명합니다. 우리의 방법은 간단 하 고 유전자 변형 또는 돌연변이 라인에 직접 적용 합니다. 더 큰 엽록체 자당 유도 된 클러스터 가드 셀의 셀 생물 학적 특징으로 표시 됩니다. 또한, 대뇌 피 질의 microtubules의 대표적인 confocal 현미경 이미지 클러스터 된 가드 세포의 세포내 관찰의 예제로 표시 됩니다. 대뇌 피 질의 microtubules의 레이디얼 방향 간격된 가드 셀 제어 조건에서와 같이 클러스터 된 가드 셀에 유지 됩니다.
공장 stoma는 광합성과 증발, 가스 교환에 대 한 필수적인 기관 이다 그리고 stomatal 운동 이온 기반 통풍 관 및 물의 출시를 통해 감시 세포에 중요 한 변화에 의해 수행 됩니다. 현미경, 우리는 나뭇잎과 줄기의 표면에는 stomata의 간격된 분포 패턴을 관찰할 수 있다. Stomata의이 간격된 분포 stomatal 운동, 가드 셀과 표 피 세포1,2이웃 간의 이온 그리고 물 교류에 의해 규제 됩니다 있도록 간주 됩니다. 클러스터 된 stomata에 대 한 실험 유도 시스템은 stomata의 간격된 분포의 중요성을 조사 하는 데 유용 합니다.
그것은 그 stomata의 공간 클러스터링 유도 될 수 있다 감시 세포 감 별 법3,4 또는5화학 복합 치료에 대 한 핵심 유전자의 유전 수정에 의해 보고 되었습니다. 우리는 또한 중간 솔루션으로 집중 치료 설탕 자당, 포도 당를 포함 하 여 보충 및과 당 발생 stomatal 클러스터링 cotyledons 애기 thaliana 묘6의에서 보고 했다. 자당 솔루션 집중 치료는 누설을 방지 하는 세포 벽을 부정적인 영향을 제안 자당 취급 떡 표 피에서 감소 callose meristemoids와 표 피 세포를 분리 하는 새로운 세포 벽에 관찰 하 고 표 피 인접으로 가드 세포 분화 (예: 녹음 방송 요인)에 대 한 주요 유전자 제품의 소성 행동6세포. 비슷한 메커니즘은 gsl8/쵸 돌연변이7,8에 대 한 연구에서 제안 했다. 자당 포함 된 중간 솔루션을 사용 하 여 클러스터 된 stomata의 재현 유도 대 한 우리의 실험 시스템은 매우 간단 하 고 저렴 한. 그것은 또한 세포 및 표현 형광 마커 그 레이블 세포내 구조9, 유전자 변형 라인에 적용 될 때 클러스터 된 가드 셀에 골격 같은 세포내 구조를 조사 하 사용할 수 있습니다. 10.
우리는 제시한 클러스터 stomata의 유도 대 한 프로토콜 A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료. 다음과 같이,이 방법은 매우 간단 하 고 없는 전문된 기술이 필요로 하지만 효율적으로 클러스터 stomata를 일으킬 수 있다. 가드 셀의 45% 이상 3% 자당 포함 된 클러스터는 중간 솔루션 (20 개 이상의 독립적인 관측의 평균 값)6. 또한,이 실험 시스템 적용할 수 있는 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 우리의 일의 그의 종류 지원을 위한 교수 Seiichiro Hasezawa에 감사입니다. 이 작품은 과학 진흥 (JSP) KAKENHgrant 숫자 17 K 19380 18 H 05492, 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 보조금은 스미 토모 재단에서 부여 번호 160146, 및 캐논 재단 남에 대 한 일본 사회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 이 실험적인 시스템 K. a JSP KAKENHgrant 번호 26891006에서에서 재정 지원 아래 개발 되었다 우리는 로비 루이스, MSc, 원고의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 감사 합니다.
24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |