באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

דג זברה, רבייה, והטיפול הניסויים המתוארים כאן הם על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי חיים מוסדיים של המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טקסס, פרוטוקול מספר הרפתקאות בטבע-16-0127. 1. צמיחה ותחזוקה של Paramecia להשיג paramecia בשידור חי תרבויות ממקורות כגון מרכז משאבים הבינלאומי דג זברה (ZIRC). מתרבות גדל בשידור חי, להוסיף 1 מ”ל של התרבות paramecia, 1 מ”ל של תרבות MG1655 e. coli (צפיפות אופטית OD600 1.0-2.0) resuspended 1 x E3 (0.29 g/L NaCl, 13 mg/L. אשלגן כלורי, 44 מ ג/ליטר CaCl2, 81 מ ג/ליטר MgSO4 0.48 g/L HEPES, pH 7.0, סטרילי), ו- 8 מ של 1 x E3 לתוך בקבוקון תרביות רקמה 10 מ”ל. מערבולת בקלילות ולאחר מכן אחסן ב 22 º C. כדי לשמור על תרבות, כל שבועיים, המעבר 1 מ”ל של תרבות paramecia לתוך בקבוקון תרביות רקמה 10 מ”ל עם 9 מ של טרי בינוני x E3 1 המכיל 108 CFU/mL של e. coli MG1655 resuspended 1 x E3. 2. קביעת המינון חיידקי מנוהל על מנת דג זברה לקבוע חיידקי מחצית חיים בתוך סנדליתהערה: זמן מחצית החיים של חיידקים בתוך paramecia נקבעת על ידי ציפוי קיימא e. coli התאוששה סנדלית, כמתואר להלן. בעקבות 2 h דגירה של חיידקים (OD600 של 1.0) עם paramecia ב 22 ° C, לשלב את paramecia והתרבות חיידקים שיתוף לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את paramecia עם 1-E3, ו- count מספר paramecia למיליליטר (כפי שמתואר להלן בשלבים 3.2.7 ו 3.2.8). לאחר ספירת מספר paramecia, להסיר 50 µL של paramecia ושל התרבות חיידקי שיתוף בכל שעה (עבור 6 שעות לאחר חשיפה) ולהוסיף כל מדגם לתוך צינור mL 1.5 טריים. במקום 950 µL של חומרים פעילי שטח nonionic 1% (ראה טבלה של חומרים) בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) לתוך כל של 1.5 mL צינורות ו מערבולת עבור 1 דקות lyse את paramecia. לבצע 1:10 דילולים של כל דגימה באמצעות PBS סטרילית כמו diluent (קרי, 100 µL ב 900 µL). צלחת 100 µL של כל דילול על גבי לוחות סלקטיבי (ט LB בינוני: 1 g/L טריפטון תמצית שמרים 0.5 g/L, 1 g/L NaCl, 30 µg/mL טטרציקלין) דגירה ב 37 ° C עבור 16 h. למחרת, לספור והקלט מספר מושבות חיידקים על הצלחת (יחידות ויוצרים של המושבה, CFUs) על ידי ספירת רק מבודדים ומובחנת בודדים המושבות. זיהוי צלחת לדילול שנותן CFU 30-300. לקבוע הדילול פקטור המשמש. לדוגמה, אם µL 1 של התרבות חיידקי מעורבב עם 99 מ של PBS סטרילי, זוהי לדילול בטחונות (0.01). מספר זה יהיה מספר CFU בהדילול. לבצע את החישוב להלן, על כל נקודת זמן, כדי לקבוע את CFU במדגם המקורי: לחשב, גרף את המספר של קיימא e.coli/סנדלית המתאימה לשעות פוסט החשיפה באמצעות ריכוז paramecia שחושבו בצעד 3.3.1 ולקבוע זמן מחצית החיים בתוך paramecia (איור 1). באמצעות CFU את המספר מחושב עבור כל נקודת זמן, לחשב גרף של המספר של קיימא e. coli לכל סנדלית בציר ה-y לעומת שעות שלאחר הדגירה בציר ה-x, באמצעות ריכוז paramecia שחושבו בצעד 3.3.1. לקבוע את זמן מחצית החיים בתוך paramecia. לקבוע מינון מ- half-life חיידקי חיידקי, ובעידן לדרג.הערה: כדי לקבוע את המינון חיידקי, זמן מחצית החיים של החיידקים בתוך paramecia הקצב הצייד של דג זברה על paramecia (ראה שלב 3.4) יש לקחת בחשבון. השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע חיידקי הריקבון בתוך paramecia:(1)כאשר N0 הוא הכמות הראשונית של חיידקים לכל paramecia לאחר הדגירה 2 h, Nt הוא הכמות הנותרת לאחר זמן t, τ הוא הזמן לאחר מכן מספר החיידקים קיימא יש חצוי ו k הוא קבוע דעיכה. מהניסוי השפלה, לקבוע את k קבוע דעיכה באמצעות חיידקים זמן מחצית החיים (כלומר, הזמן שלאחריו יש כמות החיידקים קיימא/סנדלית חצוי).(2)מצפני half-life, המונח ,(3) או(4)הערה: בהתבסס על איור 1, זמן מחצית החיים של e. coli ב paramecia הוא כ- 2.3 h. לכן, באמצעות נוסחה (4), קצב הדעיכה, k, e. coli הוא:(5) לקבוע את קצב הדעיכה (k) מהניסוי מחצית חיים כדי למצוא את המינון של חיידקים קיימא (Nt) נלקח על ידי הזחלים דג זברה אחרי פעם טרף ושהם (t), איפה (P) את שיעור טרף ושהם או מספר paramecia נאכלים על ידי דגים אחת לשעה:(6) או(7)הערה: לכל איור 1, הכמות הראשונית של חיידקים לכל paramecia (N0) לאחר דגירה 2 h (t) הוא 790 CFU. לכל סרט 1 ו- 2 איור, שיעור טרף ושהם (P) הוא 1539. שימוש בערכים אלה כדי מחליפים במשוואה (7), חישוב המינון חיידקי נצרך על ידי דג לאחר דגירה של 2 h כמו:(8) 3. שמקורם במזון זיהום של דג זברה דגירה חיידקים עם Paramecia. להכין תרבות משותפת של paramecia ו- e. coli MG1655 בלילה לפני זיהום. לשלב 8 מ של E3 מדיה 1 מ”ל של תרבות paramecia מתמשך, 1 מ”ל של תרבות MG1655 e. coli (OD600 = 1.0) resuspended 1 x E3 ב T25 תרביות רקמה מבחנות. דגירה המבחנות בטמפרטורת החדר (RT) בן לילה. עבור כל תנאי הטיפול, להכין שתי צלוחיות של paramecia. לחסן את התפתחות חיידקים מדיה (LB: 1 g/L טריפטון, תמצית שמרים 0.5 g/L, 1 g/L NaCl) עם מדבקת של חיידקים, על-ידי בחירת של מושבת חיידקים בודדים מצלחת באמצעות לולאה חיסון סטרילי. דגירה התרבות נוזלי ב 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר רועדת-110 סיבובים לדקה (סל ד) בן לילה.הערה: ציוד מגן אישי (מעיל מעבדה וכפפות) צריך להיות שחוקים, אבטחה ברמה 2 מתקנים אמור לשמש בעת טיפול מדבקים. ביום הבא, למדוד את יתר600 של התרבות לילה. חישוב הנפח של תרבות הדרוש להשגת של יתר600 1 בעת resuspended ב- 11 מ של מדיה. לקצור את עוצמת הקול של חיידקים מהשלב 3.1.2 באמצעות צנטריפוגה בגובה 6000 x g עבור 5 דקות, אמצעי אחסון אחד עבור כל הבקבוק של paramecia. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר חיידקי ב 1 מ”ל של מדיה E3. באופן אופציונלי, מראש כתם של חיידקים הפלורסנט. להוסיף 1 µL של FM 4-64FX חיידקי כתם (פתרון מניות 5 מ”ג/מ”ל). מכסים צינור עם רדיד כדי להגן מפני photobleaching, דגירה מסתובב מעל קצה-ב RT למשך 15 דקות. להסיר עודפי צבע על-ידי כביסה עם 1 x E3: גלולה חיידקים באמצעות צנטריפוגה ב x 6,000 g 1.5 דקות ולאחר מכן resuspend צנפה ב 1 מ”ל של מדיה E3. חזור על שלב לשטוף פעמיים. הקציר מוכתם חיידקים באמצעות צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר חיידקי ב 1 מ”ל של מדיה E3. להוסיף 1 מ”ל של המתלים חיידקי כל אחד שתי המבחנות של paramecia טריים. דגירה-RT כבר שעתיים.הערה: אם עובדים עם חיידקים מוכתם, דגירה בחושך ב RT כבר שעתיים. שטיפת חיידקים/paramecia תרבות משותפת. לשלב את התוכן של שתי צלוחיות של תרבות משותפת paramecia/חיידקים לתוך צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה דגימות ב x 300 גר’ ב- 15 מעלות במשך 10 דקות ודא לצנטריפוגה טרום מקורר לפני צעד זה. להסיר כ- 10 מ”ל של תגובת שיקוע E3 באמצעות פיפטה סרולוגית ולהוסיף כ 10 מ ל 1 טריים x E3 אל הצינור חרוט.הערה: במהלך כל השלבים לשטוף, זה הכרחי כדי להיות מהירה מאוד בעת הסרת את תגובת שיקוע, כמו paramecia יתחילו לשחות מחוץ בגדר. ספין להסיר תגובת שיקוע שפופרת אחת בכל פעם על מנת להבטיח טיפול מהיר מספיק בשלב זה, ואתה למנוע אובדן paramecia ב תגובת שיקוע. ספין דגימות באמצעות צנטריפוגה ב g x 300 ב 15 מעלות צלזיוס במשך כ- 10 מ”ל של תגובת שיקוע E3 באמצעות פיפטה סרולוגית להסיר 5 דק, להוסיף כ- 10 מ”ל של טרי 1 x E3 אל הצינור חרוט. חזור על שלב זה פעמיים. צנטריפוגה דגימות ב x 300 גרם ב 15 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להסיר כ- 10 מ”ל של תגובת שיקוע E3, מטפל לא להפריע בגדר. Resuspend צנפה לתוך mL 10 הנותרים של E3 מדיה ולהעביר µL 500 של ההשעיה לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge. גלולה את µL 500 של paramecia על ידי צריך שתוציאו ב x 300 גרם במשך 5 דקות כדי לספור את מספר paramecia. הסר µL 400 של E3 supernatant מדגם 500 µL. להוסיף µL 100 הנותרים של paramecia µL 20 של 36.5% פורמלדהיד פתרון בעדינות resuspend ואת תקופת דגירה של 5 דקות-22 מעלות צלזיוס.הערה: שלב זה הורג את paramecia כדי לאפשר ספירה. למדוד בפועל הנפח הכולל באמצעות פיפטה הרשומה. לדלל את paramecia ההשעיה 1:1 v/v עם פתרון trypan blue 0.4%. השתמש תא מונה או hemocytometer כדי לספור את מספר paramecia מת/mL.הערה: בגלל השלב פיקסציה מוקדמת, paramecia רוב ימות בנקודה זו, אך מספר זה משקפים את מספר paramecia חיים לניסוי משותף הדגירה. המחברים לא מצאו paramecia משמעותי למוות בשל הדגירה שיתוף חיידקי, אז זה יכול להיות התעלמו כגורם כאן. שיתוף תדגור הזחלים Paramecia , דג זברה לחשב את הריכוז של paramecia:הערה: חישוב זה נותן את ריכוז paramecia בצינור חרוט 50 מל מ שלב 3.2.5. חישוב הנפח של שטף paramecia נדרש ריכוז של 2 x 105 paramecia/mL באמצעי אחסון הסופי של 3 מ”ל של E3.הערה: הריכוז של paramecia ניתן להתאים בהתבסס על המינון הרצוי חיידקי, הכפוף אופטימיזציה. עזים ומתנגד דג זברה על-ידי הוספת tricaine 100 מ מ טריס pH 8.0 כדי ריכוז סופי של 100 מ ג/ל’ העברת 10 דג זברה לתוך כל טוב של צלחת 6-ובכן לתוך הנפח הכולל של 3 מ”ל של E3 טריים המכילים הריכוז המתאים של paramecia (שחושבו בצעד 3.3.2). ודא להעביר הזחלים בכמות מינימלית של נוזלים, כדי להבטיח שהם להתאושש הרדמה בבאר הנמען. דגירה ב 30 ° C עבור 2 h ב חממה ההשתנות היומית בתנאים באור יום, כדי להבטיח תנאי תאורה אופטימלית עבור נפילת אפים. רחץ דג זברה לפחות 5 פעמים על ידי העברת דגים לתוך חדש טוב המכיל 3 מ”ל של E3 טריים המכיל 100 מ ג/ליטר tricaine בכל פעם.הערה: אל תנסו להשמיט את tricaine במהלך השלב כביסה. העברת הזחלים ניידים ללא הרדמה מגביר את הסיכון של נזק ומצוקה לחיה. לחלופין, להכין דג זברה הדמיה על ידי שתילת דג זברה ב- 3 מ”ל של 1% agarose נמוך-להמיס לתוך צלחת 6-ובכן עם קירות שחור: agarose נמוך-להמיס שהוכנה במעבדה 1xE3, מחוממת במיקרוגל. לאחר מותך, להוסיף tricaine ריכוז סופי של 160 מ”ג/מ”ל. תנוחת הדג תחת stereomicroscope, באמצעות ג’ל החתוכים טעינת עצה, מוודא כי הראש בצד השמאל ואת הזנב הוא בצד הימין (איור 3). לחכות חמש דקות agarose להגדיר ולאחר מכן כיסוי הדג מוטבעים עם 1 x E3 המכילים 160 מ”ג/מ”ל tricaine עבור הדמיה. לקבוע את שיעור טרף ושהם.הערה: לא ניסוי נפרד צריך להגדיר כדי לקבוע את שיעור טרף ושהם. במקום זאת, ניתן לבצע זאת במהלך שלב 3.3.4, כמתואר להלן. במהלך שלב 3.3.4, תחביבים טרף ושהם דג זברה stereomicroscope וללכוד קטעי וידאו של לכידת הטרף. תוצאת הצילום וידאו. לכידת הטרף מאופיין על ידי ההכאה של דג זברה לעבר הטרף. נחשב בכל מכה אירוע ללכוד טרף אחד, למרות זאת הוא רק הערכה (ראה דיון). לחשב את המספר הממוצע של אירועים ללכוד טרף לשעה של סרטוני וידאו מרובים, שכל אחד מהם מייצג זחל דג זברה שונים (איור 2).