تحديد وسطاء من خلايا تي مستقبلات الإشارات عن طريق فحص مكتبات المانع الكيميائية
Summary
يستخدم هذه الورقة مقايسة على أساس التدفق الخلوي لمكتبات الشاشة من الموانع الكيميائية لتحديد الموانع وأهدافها التي تؤثر على خلايا تي مستقبلات الإشارات. ويمكن أيضا توسيع الأساليب الموصوفة هنا لغربلة الفائق.
Abstract
إشارات مستقبلات خلايا تي (تكر) مما يشير إلى مسار يضم العديد من الوسطاء أن يحيل على تفعيل تكر. تم اقتراح استراتيجيات مختلفة وتنفيذها للتعرف على الوسطاء جديدة من إشارات تكر، الذي من شأنه تحسين فهم العمليات تي خلية، بما في ذلك تفعيل واختيار الغدة الصعترية. يصف لنا مقايسة فرز التي تمكن من تحديد الجزيئات التي تؤثر على إشارات تكر استناداً إلى تنشيط تطوير الثيموسيه. إشارات “قوية تكر” يتسبب الثيموسيه النامية لتفعيل إليه أبوبتوتيك في عملية تعرف بالتحديد السلبي. من خلال تطبيق مثبطات كيناز، تلك الأهداف التي تؤثر على إشارات تكر قادرون على تجاوز عملية الانتقاء السلبي. يمكن استخدام الأسلوب بالتفصيل في هذه الورقة لتحديد مثبطات مؤنزم المتعارف عليه مع الأدوار المحددة في مسارات إشارات تكر ومثبطات مؤنزم جديدة بعد أن تقام في مسارات إشارات تكر أيضا. يمكن تطبيق استراتيجية الفرز هنا للشاشات لإنتاجية أعلى لتحديد أهداف دروجابل الرواية في إشارات تكر.
Introduction
خلايا T هي نسب للخلايا اللمفاوية التي تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على مناعة التكيفية. وهم يعربون عن تكر، التي تسمح لهم بالتعرف على يغاندس، مجمعات تتكون من جزيء هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية المعقدة (MHC) مع ببتيد منضم، التي توجد على أسطح مستضد-عرض الخلايا (Apc). تحريك تكر مما يشير إلى المسار عن طريق التفاعل تكر/MHC أمرا حاسما لتنشيط خلايا تي والتنمية1.
تي خلية التنمية، المشتقة من نخاع العظام الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) تهاجر إلى الغدة الصعترية، حيث تخضع للتمايز وتذهب من خلال مراحل تطور نسب تي خلية2. الثيموسيه (DP) إيجابية مزدوجة، إذ تعرب عن كوريسيبتورس كل من خلايا CD4 و CD8، الدخول مع المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/MHC على المصفحتين. الثيموسيه ن بهم يغاندس المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/MHC مع المعتدلين ناضجة لتصبح الثيموسيه (SP) CD4 أو CD8 إيجابية واحدة، عملية توصف بالتحديد الإيجابي. على العكس من ذلك، تخضع الثيموسيه التي تلقي التحفيز تكر المفرط عن طريق المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/مهكس المبرمج عن طريق الانتقاء السلبي3،4. يمكن أن تكون هذه العملية من المبرمج الناجمة عن التحفيز، وتعتمد على كاسباسي تحاكي في المختبر بحفز نمو، على سبيل المثال مع الخرز المغلفة بالأجسام المضادة-CD3/285. يتم تنشيط خلايا تي الناضجة التي تمر بعملية التحديد من يغاندس غير-الذاتي-الببتيد/MHC من ناقلات الجنود المدرعة في المحيط. المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/مكس لا تزال ذات الصلة لخلايا تي الطرفية، في سياق منشط إشارة للبقاء على قيد الحياة وانتشار التماثل الساكن، والتفريق بين خلايا تي مساعد، وتعزيز الاستجابات تي خلية لغير-الذاتي-الببتيد/مكس من خلال كواجونيسم6،7،،من89. عالية تقارب تكر ملزمة ليجند الببتيد/MHC ينشط عدة مسارات إشارات المصب، التي تنطوي على العديد من الجزيئات مما يشير إلى تشكيل تكر معقدة إشارات الشبكة10. مسارات إشارات تكر قد درست لعدة عقود، وبعد اكتشاف الوسطاء الجديد المسار يظهر أي علامة على التراجع11،12. تحوير تكر مسارات الإشارات أهميتها السريرية ويمكن أن تنطوي على قد تي خلية الاستجابات للطلبات إيمونوثيرابيوتيك أو تثبيط الاستجابات تي خلية لمراقبة المناعة الذاتية13. استراتيجيات لتحوير الردود تي خلية تعتمد أساسا على تعطل كيناز أو الفوسفاتيز النشاط14،،من1516.
يصف لنا طلبا مقايسة على أساس التدفق الخلوي لفحص المركبات الكيميائية الصغيرة لقدرتها على تعدل الإشارات تكر وتي خلية التنشيط17. المقايسة يتوقف على ظاهرة نمو تنشيط المسار المبرمج عند التعرض لإشارات تكر قوية. المقايسة حساسة بما فيه الكفاية التعرف على التغيرات في قوة التحفيز؛ حضانة الثيموسيه معربا عن تكر المحورة وراثيا مع tetramers الببتيد/MHC مع زيادة تقارب أدت إلى زيادة مقابلة في كاسباسي التنشيط المستخدمة كتدبير من تدابير الاستجابة apoptotic5. على الشاشة، واستخدمنا مكتبة مثبطات كيناز وتقييم قدرتها على تعدل ثيموسيتي استجابة لإشارات تكر قوية.
وقد وصف العديد من الاستراتيجيات القائمة على التدفق الخلوي أو المستندة إلى المحرر الأسفار للفرز الفائق لمجموعة متنوعة من التنشيط الطرفية تعمل في مجموعات فرعية تي خلية مختلفة. وتشمل هذه الاستراتيجيات استخدام الصحفيين الفلورسنت الوراثية تقييم التوقيت وحجم تي خلية التنشيط18، استخدام تحبب كقراءات من نشاط خلايا T السامة للخلايا19،20، والتحليل الفسفرة بروتينات المختلفة المشاركة في الخلوية مما يشير إلى21.
الفحص فحص المعروضة هنا غير قادرة على تحديد المركبات التي تمنع الجزيئات الكنسي تكر إشارات الطريق، فضلا عن المركبات المحتملة، ورواية مع الآثار المثبطة على إشارات تكر بنجاح. على سبيل المثال، حددنا مثبطات GSK3β و Hsp90 كالمركبات الجديدة التي تؤثر على استجابات تي خلية17. المقايسة غير قادرة على التمييز بين الموانع التي تتداخل مع توصيل الإشارة، إلى انخفاض في استجابة أبوبتوتيك، من آثار مثبطات تكر مستقلة عن السمية الخلوية. بالإضافة إلى تنظيم دورات تعريفية للمبرمج، نحن أيضا قياس أوبريجوليشن CD69 وتكر downregulation كعلامات للتنشيط. كما تكر إشارات شبكات معقدة، يمكن استخدام قراءات متعددة زيادة فرص اكتشاف الجزيئات ذات آثار محددة على مسار واحد. هنا، نحن نقدم أيضا استخدام بروتوكول مستقل عن الطرد المركزي كبديل الفائق للبروتوكول الأصلي أثناء تلطيخ الخلايا في التحضير لتحليل تدفق سيتوميتريك. الفحص المبينة في هذه الورقة يستخدم مكتبة مجمع صغير من مثبطات كيناز ولكن، من حيث المبدأ، يمكن استخدامه لفحص إنتاجية أعلى. يمكن أن تتضمن المكتبة لاختيار أيضا مجموعة متنوعة من مثبطات أو جزيئات أخرى.
Protocol
واستخدمت في هذه الدراسة، 6-8 أسبوع ذكور وإناث الفئران C57Bl/6. وقد ولدت الفئران في منشأة الحيوان في “جامعة سنغافورة الوطنية” (سنغافورة). جامعة سنغافورة الوطنية المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC) وافق جميع التجارب الحيوانية. 1-إعداد تعليق ثيموسيتي Euthanize الفئران في دائرة2 CO. الخطوات اللاحقة في غطاء زراعة أنسجة لتجنب أي تلوث للثقافات الخلية. تأمين الذبيحة الماوس إلى المجلس التشريح، باستخدام دبابيس، ورذاذ الماوس مع الإيثانول 70%. باستخدام مقص، جعل شق عمودي على الجانب البطني، بدءاً من البطن نحو الفك. بذل مزيد من شقوق على طول كل من الخلفيتين. تمدد الجلد لفضح القفص الصدري ودبوس. قطع الحجاب الحاجز وعلى جانبي القفص الصدري من الجهة الخلفية مع زوج من مقص. رفع القفص الصدري ودبوس وصولاً إلى فضح الغدة الصعترية. فصل الأنسجة الضامة يعلق على الغدة الصعترية واستخراج الغدة الصعترية استخدام زوج من الملقط منحنية. مكان الغدة الصعترية في بئر لوحة 6-جيدا يحتوي على 5 مل من وسائط الإعلام ربمي كاملة.ملاحظة: النظر في إضافة 10% الفحم جردت الجنيني البقري المصل (FBS) لوسائل الإعلام لتحسين جدوى ثيموسيتي إذا كانت فترة طويلة من المتوقع وقت الانتظار بين التشريح والتحليل التحفيز. بلطف الهريس الغدة الصعترية، استخدام نهاية حادة للمحاقن، وتمرير الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر. وبدلاً من ذلك، جمع الثيموسيه في حالة صحية، النظر في استخدام اثنين من أزواج من الملقط للضغط الغدة الصعترية، وجمع الثيموسيه هذا التدفق من ظهارة الغدة الصعترية. الانتقال إلى خلية العد، استخدام هيموسيتوميتير أو أي خلية الآلي أداة العد. 2-معايرة Kinase مثبطات لتركيزات غير سام ملاحظة: يركز هذا القسم على إعداد مثبطات للاستخدام في شاشات تي خلية التنشيط. مثبطات تستخدم بتركيزات عالية يمكن أن يسبب موت الخلايا، وقراءات شاشات تي خلية التنشيط. سلسلة تخفيف الأهداف مثبطات لتحديد تركيز مثبطات الفردية التي لا ينبغي أن تحفز المبرمج مستقلة من التحفيز تكر النهائي. مكتبة kinase مثبطات المستخدمة في هذه الدراسة تم شراؤها من مورد خارجي. يتم تضمين قائمة مثبطات في الجدول للمواد. إعداد لوحات مثبطات كيناز في تركيزات أقل لتحضير طبق مثبطات في 1 مم، إضافة 10 ميليلتر من مثبطات إلى 90 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لجميع مثبطات.ملاحظة: تأتي مثبطات من مكتبة جزيء الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة بتركيز أسهم من 10 ملم. في حالة في نموذج بيليه مثبطات، اتبع الخطوات الموصى بها إعادة تشكيل من الموردين. إذا لم تقدم الموانع في 10 ملم، إعداد لوحات المانع بتركيزات مناسبة بديلة بدلاً من ذلك، وإعداد تخفيف المسلسل منفصلة من مثبطات مع عامل تخفيف مناسبة.تنبيه: في حالة مثبطات السامة، اتبع إرشادات الشركة المصنعة على المناولة الآمنة والتخلص منها. لتحضير طبق مثبطات 0.1 ملم، إضافة 10 ميليلتر من مثبطات من اللوحة مثبطات 1 مم إلى 90 ميليلتر من [دمس]. لتحضير طبق مثبطات 0.01 ملم، إضافة 10 ميليلتر من مثبطات من اللوحة مثبطات 0.1 مم إلى 90 ميليلتر من [دمس]. علاج الثيموسيه مع مثبطات كيناز إعداد تعليق ثيموسيتي وفقا للمادة 1. تمييع الثيموسيه في ربمي كاملة للحصول على تعليق ثيموسيتي 5 × 106 خلايا/مل. إضافة 200 ميليلتر من تعليق ثيموسيتي لجميع الآبار من لوحة 96، حسنا، استخدام ماصة الأقنية. لكل بئر، إضافة 2 ميليلتر من مثبطات من المقابلة جيدا لصفيحة تحتوي على مثبطات 1 مم (تركيز مثبطات النهائي هو 10 ميكرومتر). في نفس اللوحة، إعداد أربعة آبار الضوابط غير المعالجة وأربعة آبار ميكرومتر 5 يعامل الديكساميتازون من عناصر إيجابية وأربعة آبار للمعالجة بالمركبات عناصر سلبية، بإضافة 2 ميليلتر من [دمس]. احتضان الثيموسيه في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ح 17-20 (أو بين ليلة وضحاها). تحديد تركيزات مناسبة من مثبطات الفردية وتدور اللوحة نمو في 300 x ز 4 درجة مئوية، للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية. تشغيل تحليل تدفق سيتوميتريك من العينات وتحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل تدفق الخلوي. تحديد النسبة المئوية للخلايا الحية استناداً إلى النابضة منتدى التعاون الأمني-التعاون بين بلدان الجنوب. ويبين الشكل 1Bالاستراتيجية النابضة. حساب متوسط النسبة المئوية للخلايا الحية استناداً إلى الضوابط يعامل [دمس]، والتي يتم تطبيع نسبة 100%. تعيين إطار تعسفي لموت الخلية مقبولة (e.g.,20%). مثبطات أسفرت عن نسبة مئوية من الخلايا الحية تحت هذا الإطار (أي.وأقل من 80% عناصر المعالجة [دمس]) أن تختبر مرة أخرى بتركيزات أقل. للموانع التي لم يمر معايير السلامة في خطوة 2.3.4، كرر الخطوات من الخطوات 2.2.1-2.3.4، ولكن استخدام اللوحة مثبطات 0.1 مم للخطوة 2.2.4 بدلاً من اللوحة التي تحتوي على مثبطات 1 مم. التركيز النهائي لمثبطات المستخدمة هنا هي 1 ميكرومتر. للموانع التي لا تزال تنتج مستويات عالية من موت الخلايا في 1 ميكرومتر، واختبار مثبطات في 0.1 ميكرومتر. كرر الخطوات 2.2.1-2.3.4، ولكن استخدام اللوحة مثبطات 0.01 ملم في خطوة 2.2.4. التركيز النهائي لمثبطات المستخدمة هنا هو 0.1 ميكرومتر. إعداد لوحة الأسهم من مثبطات كيناز لمثبطات لاستخدامها في 10 ميكرومتر، إضافة 10 ميليلتر من مثبطات 10 ملم إلى 10 ميليلتر من [دمس]. لمثبطات لاستخدامها في 1 ميكرومتر، إضافة 1 ميليلتر من مثبطات 10 مم إلى 19 ميليلتر من [دمس]. لمثبطات لاستخدامها في 0.1 ميكرومتر، إضافة 1 ميليلتر من مثبطات 10 ملم إلى 199 ميليلتر من [دمس] (الشكل 1).ملاحظة: لوحة الأسهم المعدة لمثبطات هو 500 × تركيز تركيز النهائي المقصود عند إضافة إلى أن الإيقاف ثيموسيتي. يمكن إعداد لوحة الأسهم من مثبطات في شرائط بكر أو في لوحات 96-جيدا. يمكن تطبيق لوحة الأسهم من مثبطات كيناز الثيموسيه للفحص في نظام تعتمد على الطرد المركزي التقليدي (القسم 3) (انظر الشكل 1A، أساليب 1 و 2) أو في نظام مستقل عن الطرد المركزي بديل (القسم 4؛ انظر الشكل 1A، أسلوب 3). 3-kinase مثبط مكتبة الفحص (الفحص التقليدية المستندة إلى أجهزة الطرد المركزي) علاج الثيموسيه مع مثبطات كيناز إعداد تعليق ثيموسيتي وفقا للمادة 1. تمييع الثيموسيه في ربمي كاملة للحصول على تعليق ثيموسيتي 5 × 106 خلايا/مل. إضافة 200 ميليلتر من الثيموسيه لكل بئر من لوحة 96، حسنا، استخدام ماصة الأقنية. وضع اللوحة على الجليد. إضافة إعداد 0.5 ميليلتر من مثبطات للوحة 96-بئر من آبار مثبط لوحة الأسهم المقابلة في الفرع 2-4. إعداد الآبار ثمانية من عناصر التحكم غير المعالجة. إعداد أربعة آبار ضوابط التعامل مع السيارة بإضافة 0.5 ميليلتر من [دمس]. إعداد أربعة آبار 5 ميكرومتر ضوابط التعامل مع الديكساميتازون (الشكل 2). حفز نمو استخدام الخرز المضادة-CD3/CD28 أخذ 1 مل خرز وتغسل الخرز مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. فصل الخرز استخدام موقفا مغناطيسية ونضح الحل. ريسوسبيند الخرز في 5 مل ربمي كاملة.ملاحظة: نسبة الخرز للخلايا هي 1 إلى 2.5. ضبط كمية حبات اتخاذ، اعتماداً على العدد الآبار لتحفيز وعدد الثيموسيه المستخدمة. إضافة 50 ميليلتر من حبات لكل نموذج المعالجة بمثبطات والعينات المعالجة [دمس] أربعة، وأربعة من ثمانية عينات غير المعالجة. إضافة 50 ميليلتر من ربمي كاملة إلى الآبار غير المعالجة الأربعة المتبقية. ويبين الشكل 2 التخطيط العام اللوحة. خلط محتويات الآبار استخدام ماصة الأقنية. احتضان الثيموسيه في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ح 17-20 (أو بين ليلة وضحاها). تلوين المستضدات السطحية إعداد خليط المصبوغة جسم مادة تحتوي على TCRβ مكافحة ومكافحة CD4، CD8 مكافحة والأجسام المضادة-CD69. تمييع الأجسام المضادة في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع ألبومين المصل البقري 0.5% [جيش صرب البوسنة]) بنسبة 1: 200 (v/v).ملاحظة: النظر في الاستفادة المثلى من التتر جسم تستخدم لتلطيخ، بدلاً من استخدام تخفيف جسم ثابت، للتقليل من التباين في تلطيخ عبر تجارب مختلفة، وتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. تدور اللوحة في 300 x ز و 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق. فليك لوحة لتجاهل الحل. عند هذه النقطة، يمكنك اتباع البروتوكول البروتوكول تعتمد على الطرد المركزي التقليدي (المضي قدما إلى الخطوة 3.3.5؛ انظر الشكل 1A، الأسلوب 1) أو بروتوكول مستقل عن الطرد المركزي البديلة (المضي قدما إلى الخطوة 4.4.4؛ انظر الشكل 1A، الأسلوب 2). ريسوسبيند الخلايا في 75 ميليلتر من خليط جسم المصبوغة إعدادها في الخطوة 3.3.1. خلط العينات باستخدام ماصة الأقنية واحتضانها لهم على الجليد لمدة 30 دقيقة. تثبيت خلايا غسل الآبار مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية وتدور لوحة 300 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. فليك لوحة لتجاهل الحل. إضافة التثبيت/permeabilization المخزن المؤقت (يأتي مع مجموعة نشطة caspase-3 المبرمج؛ نفس الشيء مع 10 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت المذكور في الخطوة 3.5.1 والأجسام المضادة-caspase-3 في الخطوة 3.5.2) في 200 ميليلتر كل بئر. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة. داخل الخلايا تلطيخ لنشاط caspase 3 إعداد x 1 بيرم/يغسل المخزن المؤقت بتمييع مل 5 x 10 بيرم/يغسل مخزن في 45 مل الماء عالي النقاوة. تعد وصمة عار caspase النشطة داخل الخلايا عن طريق إضافة 1.3 مل الأجسام المضادة-caspase-3 إلى 6.5 مل 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت. نسبة الأجسام المضادة بيرم/يغسل المخزن المؤقت هي 1:5. تدور اللوحة في 300 x ز و 4 درجة مئوية، للحد الأدنى 5 نفض الغبار لوحة لتجاهل الحل. أغسل اللوحة مع 200 ميليلتر x 1 بيرم/يغسل المخزن المؤقت. كرر الخطوة 3.5.3. تدور اللوحة في 300 x ز و 4 درجة مئوية، للحد الأدنى 5 نفض الغبار لوحة لتجاهل الحل. إضافة ميليلتر 75 من وصمة caspase داخل الخلايا التي أعدت في خطوة 3.5.2 لجميع الآبار. خلط العينات باستخدام ماصة الأقنية واحتضان على الجليد ح 1. تغسل العينات مع 200 ميليلتر x 1 بيرم/يغسل المخزن المؤقت وتدور اللوحة في 300 x ز و 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق. فليك لوحة لتجاهل الحل. أغسل اللوحة مع 200 ميليلتر x 1 بيرم/يغسل المخزن المؤقت. تدور اللوحة في 300 x ز و 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق. فليك لوحة لتجاهل الحل وريسوسبيند العينات في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية. تشغيل تحليل تدفق سيتوميتريك من العينات وتحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. استخدام مقابل CD8 CD4 مؤامرة، بوابة على سكان الثيموسيه DP مع تعبير إيجابي CD4 و CD8 (الشكل 2، أسفل النصف). داخل بوابة ثيموسيتي DP، تحديد النسبة المئوية للخلايا مع تفعيل caspase-3، استخدام نموذج أونستيمولاتيد كمراقبة سلبية والديكساميتازون كعنصر إيجابي. تحليل للتعبير عن CD69 في بوابة ثيموسيتي موانئ دبي، استخدام نموذج أونستيمولاتيد كمراقبة سلبية وحفز العينة كعنصر إيجابي.ملاحظة: عند النابضة في نمو DP، تحقق من أن سكان الثيموسيه DP هو بوابة بشكل صحيح للعينات الفردية. حفز الخلايا دوونريجولاتي كوريسيبتورس السطحية، واستبعاد غير مقصودة من الأحداث يمكن أن يحدث إذا تم استخدام بوابة DP ضيق. 4-كيناز المانع مكتبة الفحص (الفحص مستقلة عن أجهزة الطرد المركزي) علاج الثيموسيه مع مثبطات كيناز إعداد تعليق ثيموسيتي وفقا للمادة 1. تمييع الثيموسيه في ربمي كاملة للحصول على تعليق ثيموسيتي 25 x 106 خلايا/مل. إضافة 40 ميليلتر من الثيموسيه لكل بئر من لوحة صغيرة الحجم، استخدام ماصة متعددة القنوات. وضع اللوحة على الجليد. تمييع مثبطات من لوحة الأسهم, [دمس]، والديكساميتازون في ربمي كاملة بنسبة أربعة أجزاء من ربمي كاملة على جزء واحد من المانع/[دمس]/الديكساميتازون (عامل التخفيف من 5).ملاحظة: ما هي وحدات التخزين المستخدمة في هذه اللوحة صغيرة الحجم 5 × أصغر في الطريقة التقليدية، مثبطات والكواشف التحكم هي المخفف خمسة إضعاف قبل إضافتها إلى نمو في اللوحة. إضافة 0.5 ميليلتر من مثبطات للوحة 96-بئر من آبار المقابلة من مثبط لوحة إعدادها في الخطوة 4.1.4. إعداد الآبار ثمانية من عناصر التحكم غير المعالجة. إعداد أربعة آبار ضوابط التعامل مع السيارة بإضافة 0.5 ميليلتر من [دمس] أعد الخطوة 4.1.4. إعداد أربعة آبار 5 ميكرومتر تعامل الديكساميتازون عناصر التحكم، واستخدام الديكساميتازون المخفف إعدادها في الخطوة 4.1.4 (الشكل 2). حفز نمو استخدام الخرز المضادة-CD3/CD28 تأكد من أن يتم انتظام حراكه الخرز. أخذ 1 مل خرز وغسلها مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. فصل الخرز استخدام موقفا مغناطيسية ونضح الحل. ريسوسبيند الخرز في 1 مل ربمي كاملة.ملاحظة: نسبة الخرز للخلايا هي 1 إلى 2.5. ضبط كمية الخرز، اعتماداً على العدد الآبار لتحفيز وعدد الثيموسيه المستخدمة. إضافة 10 ميليلتر من تعليق حبة لكل نموذج المعالجة بمثبطات والعينات المعالجة [دمس] أربعة، وأربعة من ثمانية عينات غير المعالجة. إضافة 10 ميليلتر من ربمي كاملة إلى الآبار غير المعالجة الأربعة المتبقية. ويبين الشكل 2 تخطيط لوحة عامة.ملاحظة: وحدة التخزين النهائي الآبار هي 50 ميليلتر، الذي ضمن أقصى سعة للآبار. من المهم توخي الحذر وعقد اللوحات تستقيم، لتجنب انسكاب الصليب، حسنا. مزيج، تحرض لوحة استخدام شاكر ميكروسكوبية مداري. بدلاً من ذلك، مزيج من محتويات الآبار استخدام ماصة الأقنية. احتضان الثيموسيه في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ح 17-20 (أو بين ليلة وضحاها) مع غطاء المضادة تبخر. برنامج الإعداد للوحة الغسالةملاحظة: التعليمات المتعلقة بإعداد لوحة الغسالة التي تقدمها الشركة المصنعة. وذكر الخطوات بإيجاز أدناه. تقريبا 150 مل من محلول المسبق لكل خطوة فتيلة. رئيس نظام المياه والصرف الصحي مع الإيثانول 70% يحتوي على 1% 20 توين. رئيس نظام الغسيل بالمياه التي تحتوي على 1% 20 توين. رئيس الوزراء نظام المياه والصرف الصحي مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية. تلوين المستضدات السطحية إعداد خليط المصبوغة جسم مادة تحتوي على TCRβ مكافحة ومكافحة CD4، CD8 مكافحة والأجسام المضادة-CD69. تمييع الأضداد في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية بنسبة 1: 100 (v/v). أغسل لوحة 9 x, استخدام ميليلتر 55 من نظام مراقبة الأصول الميدانية يغسل العازلة للمياه والصرف الصحي، باستخدام تدفق الصفحي الآلي الغسيل نظام.ملاحظة: في نهاية يغسل، سيكون هناك 25 ميليلتر من وحدة التخزين المتبقية في كل بئر. ريسوسبيند الخلايا في 25 ميليلتر من خليط جسم المصبوغة إعدادها في الخطوة 4.4.1. إذا كان يتم نقل العينات من صفيحة 96-جيدا (من الخطوة 3.3.4)، ريسوسبيند الخلايا في 50 ميليلتر من خليط جسم إعدادها في الخطوة 3.3.1، ونقل العينات إلى لوحة صغيرة الحجم. يتوافق مع هذه الخطوة بطريقة رقم 2، كما هو مبين في الشكل 1 ألف. خلط وتحرض اللوحة مع شاكر مداري ميكروسكوبية أو خلط العينات باستخدام ماصة الأقنية واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. تثبيت خلايا أغسل لوحة 9 x, استخدام ميليلتر 55 من نظام مراقبة الأصول الميدانية يغسل العازلة للمياه والصرف الصحي، باستخدام تدفق الصفحي الآلي الغسيل نظام. إضافة التثبيت/permeabilization المخزن المؤقت (يأتي مع مجموعة نشطة caspase-3 المبرمج؛ نفس الشيء مع 10 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت المذكور في الخطوة 4.6.1 والأجسام المضادة-caspase-3 في الخطوة 4.6.2) في 50 ميليلتر كل بئر. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة. داخل الخلايا تلطيخ لنشاط caspase 3 إعداد x 1 بيرم/يغسل المخزن المؤقت بتمييع مل 25 x 10 بيرم/يغسل مخزن في 225 مل الماء عالي النقاوة. تعد وصمة عار caspase النشطة داخل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل الأجسام المضادة-caspase-3 إلى 2 مل 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت. نسبة الأجسام المضادة بيرم/يغسل المخزن المؤقت هي 1:2. رئيس الوزراء نظام المياه والصرف الصحي مع 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت. أغسل لوحة 9 x 1 x بيرم/يغسل المخزن المؤقت، في 55 ميليلتر لكل غسل. إضافة 25 ميليلتر من وصمة عار داخل الخلايا caspase إعدادها في الخطوة 4.6.2 لجميع الآبار. خلط وتحرض اللوحة مع شاكر مداري ميكروسكوبية أو خلط العينات باستخدام ماصة الأقنية واحتضان على الجليد ح 1. أغسل لوحة 9 x 1 x بيرم/يغسل المخزن المؤقت، في 55 ميليلتر لكل غسل. إضافة 25 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية لجميع الآبار. نقل العينات إلى أنابيب microtiter بعد كافية خلط عبر بيبيتينج. إضافة آخر ميليلتر 50 من نظام مراقبة الأصول الميدانية يغسل المخزن المؤقت إلى الآبار فارغة، ثم كرر الخطوة 4.6.9. كرر الخطوتين 4.6.9 و 4.6.10 x 2 حتى 200 ميليلتر من العينات التي جمعت في أنابيب ميكروتيتير.ملاحظة: غرض الإجراءات الموضحة في الخطوات 4.6.10 و 4.6.11 ضمان تحقيق انتعاش الحد أقصى من الخلايا من لوحة صغيرة الحجم. إذا كانت أرقام الخلية لا مصدر قلق، بعد الخطوة 4.6.10، أنابيب ببساطة أعلى يصل ميكروتيتير إلى 200 ميليلتر مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية. تشغيل تحليل تدفق سيتوميتريك من العينات وتحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، حسب الخطوة 3.5.11. ويتم تحليل تفعيل Caspase-3 والتعبير CD69 في البوابة التي تحتوي على خلايا CD4+CD8+DP الثيموسيه.
Representative Results
ويلخص الشكل 1Aنهج المقايسة الفرز. تم فحص مثبطات كيناز أولاً للتأثيرات الكامنة على البقاء ثيموسيتي. واستخدمت كعنصر إيجابي للمبرمج، الديكساميتازون كعامل بروابوبتوتيك. النابضة للسكان خلية حية مصممة استناداً إلى عناصر سلبية غير المعالجة وعناصر إيجابية تعامل الديكساميتازون (الشكل 1B). جرى اختبارها مثبطات أولاً في 10 ميكرون على الثيموسيه، وتم قياس النسبة المئوية للخلايا قادرة على البقاء بعد حضانة ح 18. تم اختيار نافذة 20% لموت الخلية أن المركبات التي التي يسببها أكبر من 20% فقدان الخلايا في بوابة الخلية حية، مقارنة بالعينات المعالجة [دمس]، جرى اختبارها في تركيزات أقل (الشكل 1B). يتم إظهار الممثل مؤامرات نظام مراقبة الأصول الميدانية لعينات مختارة المعالجة بمثبطات لتوضيح مقايسة البقاء. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one؛ CAS 154447-36-6) و PI3K المانع22، لم يزدد كثيرا موت الخلية في 10 ميكرون، والمانع كان يستخدم في 10 ميكرون لفحوصات لاحقة. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide؛ CAS 1202884-94-3) ومثبط مزدوج من23من PI3Kα/mTOR، التي يتسبب فيها مستويات عالية من موت الخلايا في 10 ميكرون وعلى 1 ميكرومتر ولكن ليس على 0.1 ميكرومتر، و 0.1 ميكرومتر عاقدة العزم على أن يكون تركيز مناسب للتطبيق في فحوصات المتلقين للمعلومات. ستوروسبوريني (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3′,2′,1′-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one؛ CAS 62996-74-1)، مثبط عموم بروتين كيناز ج مع قدرة المنشأة على حمل24من المبرمج، الناجمة عن موت الخلية كبيرة في تركيزات كل اختبار، حتى في 0.1 ميكرومتر. استخدامه في الاختبارات اللاحقة في 0.1 ميكرومتر كعنصر إيجابي إضافي. واختيرت تركيزات النهائي مثبطات استناداً إلى تركيزات أعلى حيث أنهم عدم تضخيم موت الخلية بأكثر من 20 في المائة من العينات المعالجة [دمس]. مع تركيزات مثبطات العزم النهائي، أعد لوحة أسهم من مثبطات مثل أن جميع الموانع كانت 500 مرة تركيز عند تطبيقها على الخلايا. ويوضح الشكل 1 تخطيط لوحة لوحة الأسهم، مع تركيزات النهائي مثبطات. في البروتوكول بديلة لحضانة الخلايا مباشرة في لوحات صغيرة الحجم لتدفق الصفحي الغسيل المقايسة، استلزم استخدام كميات صغيرة أخرى إضعاف مثبطات. لضمان أن المحتوى [دمس] ثقافات بعد إضافة مثبطات لن عالية جداً للخلايا، مثبطات كانت كذلك تضعف في ربمي كاملة، بمعامل تخفيف من 5، أن كانوا في 100 مرة تركيز المقصود عند تطبيقه على الخلايا. مثبطات، المخفف لتركيزات غير سام، استخدمت في المقايسة لتحفيز المستحثة تكر المبرمج في الثيموسيه5،17. التحفيز أجريت باستخدام الخرز المضادة-CD3/CD28 ح 18، وكانت ملطخة الخلايا فيما بعد لتفعيل caspase-3 في خلايا CD4+ و CD8+ DP ثيموسيتي السكان (الشكل 2). زيادة تفعيل caspase-3 والتعبير CD69، وأيضا downregulation تكر، لوحظت في مكافحة-CD3/CD28-حفز و [دمس]-موك-تعامل العينات المضادة-CD3/28-حفز، مقارنة بالعينات نونستيمولاتيد. الديكساميتازون تعامل العينات أظهرت زيادة في تفعيل caspase-3 مستقلة عن أوبريجوليشن CD69، الذي يتوقع من التأثير الذي يحفز المبرمج مستقل لتحفيز تكر. الشكل 3 ألف يلخص نتائج المكتبة فحص المقايسة لمثبطات المحدد. يمكن استخدام كل من CD69 وتفعيل caspase-3 تحديد الموانع المحتملة من الاهتمام نظراً لقمع التعبير. كما هو متوقع، وأظهرت مثبطات للوسطاء المتعارف عليه من إشارات تكر كالزيارات إيجابية في الشاشات. وشملت هذه الموانع، التي أظهرت فاعلية المثبطة بدرجات متفاوتة، مثبطات واسعة الطيف التي تستهدف مؤنزم متعددة، وأيضا، أكثر مثبطات محددة. وكانت بعض مثبطات قادرة على قمع تفعيل caspase-3 وأوبريجوليشن CD69 (الشكل 3B، الصف العلوي، لوحات الأيسر). واحد مثل هذا المانع بيسيندوليلماليميدي الثاني (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione؛ CAS 137592-45-1)، مما يحول دون جميع isoforms البروتين كيناز ج، بالإضافة إلى البروتين كيناز ألف و PDK125،،من2627. مثبط آخر في هذه الفئة هو CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide؛ CAS 494772-86-0)، مثبط المقترحة من IKK228. وكانت هناك المركبات التي تحول دون أوبريجوليشن CD69 ولكن لا تنتقص من تفعيل caspase-3 (الشكل 3B، الصف العلوي، لوحات الحق). CAY10626، مثبطات PI3Kα و mTOR23، و U-0126 (2 و 3-مكررا [الأمينية [(2-aminophenyl) الايثير] الميثيلين]–بوتانيدينيتريلي؛ CAS 109511-58-2)، مثبط لمجاهدى خلق29، كانت بعض الموانع التي تم تحديدها. وتبين النتائج أن مثبطات مختلفة تستهدف مؤنزم مختلفة من فروع محددة مسار الإشارات تكر، لا سيما تلك التي تستهدف مؤنزم المرحلة المتأخرة، يمكن أن تسفر عن إعاقة انتقائية من الظواهر تي خلية التنشيط. وكانت هناك أيضا مثبطات عدم قمع كل من أوبريجوليشن CD69 وتفعيل caspase-3 (الشكل 3B، الصف السفلي، ولوحات الأيسر). باكليتاكسيل (βS-(بينزويلامينو)-αR-هيدروكسي-حمض بينزينيبروبانويك، (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 ، إستر 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl؛ CAS 33069-62-4)، disruptor microtubule ديناميات30، ونيكروستاتين-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile؛ CAS 337349-54-9)، مثبطات RIP1 كيناز31، هما مثبطات المحددة في هذه الفئة. في مثل هذه الحالات لم تكن البصر حيث أوبريجوليشن CD69 وتفعيل caspase-3، هذا يمكن أن يكون سبب مثبطات لا تستهدف كيناز ذات صلة تكر مما يشير إلى المسار. وكما ذكر آنفا، استخدمت ستاوروسبوريني في الشاشات، بتركيز لا يزال الناجمين عن المبرمج في نمو. كما هو متوقع، أظهرت العينة تعامل staurosporine مستويات عالية من تفعيل caspase-3 (الشكل 3B، الصف السفلي، والعمود الأيسر). يمكن أن يعزى انخفاض مستويات التعبير CD69 إلى تثبيط توسط staurosporine PKC، كما بيسيندوليلماليميدي الثاني، آخر PKC عموم مثبط، قمعت أيضا التعبير عن CD69. بدلاً من ذلك، ستوروسبوريني التي يسببها المبرمج في الخلايا قبل أن يتمكن أوبريجولاتي التعبير CD69. لزيادة الإنتاجية والتشغيل الآلي للبروتوكول، تم إعداد البروتوكولات المتوازية التي تنطوي على استخدام صفيحة الآلي الغسيل النظام عن طريق تدفق الصفحي. وكانت البروتوكولين منفصلة باستخدام هذا الجهاز الغسيل الآلي لوحة تجربته ومقارنة بالأسلوب التقليدي لاستزراع الخلايا في لوحات 96-جيدا وتلطيخ الخلايا في بروتوكول تعتمد على الطرد المركزي. أسلوب واحد يشارك استزراع الخلايا في لوحات 96-كذلك، ووفقا للإجراءات المعتادة، ونقل الخلايا إلى لوحات متوافقة مع الغسالة لوحة الآلي لتلطيخ الخطوات ثم، (الشكل 4، دا غسل العينات). وتشارك طريقة أخرى استزراع الخلايا في لوحات لوحة الغسالة المتوافقة مباشرة ومستمرة مع البروتوكول المصبوغة على نفس اللوحة (الشكل 4، عينات دا-الثقافة). بروتوكولات مستقلة عن الطرد المركزي لا تعطي الكثير من الخلافات ملحوظ في نشاط caspase-3، CD69، أو TCRβ تلطيخ عبر مختلف عينات اختبار، بالمقارنة مع البروتوكول التقليدية تعتمد على الطرد المركزي (الشكل 4). يمكن أن يعزى إلى الاختلافات في كثافة المصبوغة باستخدام الأجسام المضادة بتركيزات مختلفة قليلاً خلال الخطوات المصبوغة. الشكل 1 : ثيموسيتي البقاء بعد المعالجة بمثبطات. (أ) مخطط تجريبي الخطوات الرئيسية في التحليل الفحص. هناك ثلاثة أساليب المقترحة للحفز وتلطيخ من الثيموسيه المستخدمة في مقايسة التنشيط، هي: (1) استزراع الثيموسيه في لوحات 96-جيدا القياسية، متبوعاً بالتلوين باستخدام بروتوكول المستندة إلى استخدام الطرد المركزي التقليدي، (2) استزراع لنمو في لوحات 96-جيدا القياسية، متبوعاً بالتلوين باستخدام بروتوكول غسيل المستقلة الطرد المركزي، و (3) استزراع الثيموسيه في لوحات صغيرة الحجم، متبوعاً تلطيخ في لوحات نفس استخدام بروتوكول غسيل مستقلة عن الطرد المركزي. (ب) النابضة الاستراتيجيات المستخدمة في فحوصات السلامة. بوابة الخلية حية مستمدة من التشتت إلى الأمام (FSC) وقطع الجانب مبعثر (SSC)، كما هو موضح سابقا17. الموانع التي اعتبرت أن تكون سامة جداً في تركيز اختبار تخضع لفحوصات جدوى زيادة في تركيزات أقل إذ. يتم عرض عينات تمثيلية المعالجة بمثبطات. ملاحظة عنصر التحكم الشائعة (يعامل [دمس] [[دمس]]) المستخدمة ميكرومتر 1 و 0.1 ميكرومتر عينات. (ج) تخطيط لوحة من مثبطات المخفف. تمثيل تخطيطي من الألواح مثبطات المخفف في [دمس] لتركيز 500 × تركيز النهائي المقصود. كذلك يمثل كل واحد المانع فريدة من نوعها؛ الآبار الرمادية الفارغة. التركيزات التي تظهر هي تركيز النهائي عند إضافة إلى الثقافات الخلية، إلا وهي 10 ميكرون (أحمر داكن) 1 ميكرومتر (ضارب) و 0.1 ميكرومتر (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : لوحة تخطيط المقايسة التنشيط ثيموسيتي. (أعلى) الأعمدة 1 و 12 محجوزة لعناصر التحكم، بينما الأعمدة 2 إلى 11 المعالجة بمثبطات عينات (بيج). مراقبة سلبية (نونستيمولاتيد [م]؛ غراي) تحتل آبار A1 إلى D1، ومراقبة إيجابية لموت الخلية (تعامل الديكساميتازون [DEX]؛ الأرجواني) تحتل آبار E1 إلى H1. تحتوي الأعمدة 2 إلى 12 على حفز مع الخرز المضادة-CD3/CD28 الثيموسيه. مراقبة إيجابية لتنشيط ثيموسيتي (حفز عينات [α-CD3/CD28]؛ الأخضر) تحتل آبار A12 إلى D12، ومراقبة المركبات (حفز ويعامل [دمس] [α-CD3/CD28 + [دمس]]؛ وأحمر) تحتل آبار E12 إلى H12. (أسفل) التدفق الخلوي المؤامرات النشطة caspase-3 (ActCasp3)، CD69، وتلطيخ TCRβ من الثيموسيه بوابات داخل البوابة إيجابية مزدوجة (DP). تظهر قطع تمثيلية من عناصر التحكم المختلفة. NS = نونستيمولاتيد؛ DEX = الديكساميتازون تعامل العينات؛ Α-CD3/CD28 + [دمس] = عينات حفزت مع الخرز CD3/CD28-المغلفة وتعامل مع [دمس]؛ Α-CD3/CD28 = عينات حفزت مع الخرز CD3/CD28-المغلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : فحص المكتبة مثبط على التنشيط ثيموسيتي. (أ) تلخيص بيانات تحليل التنشيط. هذه هي نتائج تجربة الممثل عرض قيم الخلايا مع تفعيل caspase-3 والتعبير CD69 لمثبطات المحدد تم تسويتها. تم تطبيع بمقارنة النسبة المئوية لخلايا نشطة-caspase-3-الإيجابية أو بوابة CD69-إيجابية إلى قيمة عنصر تحكم تعامل [دمس]، التي تم تعيينها إلى قيمة نسبية 0 في الرسم البياني. (ب) “تحديد نظام مراقبة الأصول الميدانية” المؤامرات. التدفق الخلوي قطع من الموانع التي قمعت تفعيل caspase-3 و upregulation CD69 (أعلى اليسار)، قمعت فقط CD69 أوبريجوليشن (أعلى اليمين)، أو أي تأثير على تفعيل caspase-3 و upregulation CD69 (أسفل اليسار). يتم إظهار قطع العينة تعامل staurosporine لتوضيح آثار استخدام المانع تركيزات سامة (أسفل اليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : مقارنة بين البروتوكولات المختلفة المقايسة. التدفق الخلوي المؤامرات النشطة caspase-3 (ActCasp3)، CD69، وتلطيخ TCRβ من الثيموسيه DP عقب ثلاثة مختلفة الاعتداء البروتوكولات. يتم اختبار أربعة شروط مختلفة، إلا وهي مراقبة سلبية (نونستيمولاتيد [م])، مراقبة إيجابية لموت الخلية (تعامل الديكساميتازون [DEX])، ومراقبة المركبات (حفز ويعامل [دمس] [α-CD3/CD28 + [دمس]])، والمعالجة مثبطات عينة (حفز وبيك-75-يعامل [α-CD3/CD28 + بيك-75]). التقليدية = استزراع من نمو في معيار 96-جيدا لوحات وتلطيخ مع بروتوكول تقليدية المستندة إلى استخدام الطرد المركزي؛ دا-الغسيل = استزراع الثيموسيه في معيار 96-جيدا لوحات وتلطيخ استخدام تدفق الصفحي الغسيل البروتوكول؛ دا-الثقافة = استزراع الثيموسيه في لوحات صغيرة الحجم والتلوين في لوحات نفس استخدام تدفق الصفحي الغسيل البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
فحص الاستراتيجية المقترحة هنا يقيم قدرة مثبطات جزيء صغير لقمع آثار أبوبتوتيك في الثيموسيه بعد التحفيز، بالإضافة إلى علامات أكثر تقليدية تي خلية التنشيط-CD69 أوبريجوليشن وتكر downregulation . يمكن أيضا إدراجها علامات إضافية لتمكين تحليل ثيموسيتي مختلف المجموعات الفرعية32. جانبا مثيرة لاهتمام في التحليل الحالي تكمن في حقيقة أن مثبطات تعوق تكر مما يشير إلى أن يضعف أيضا تنظيم دورات تعريفية للمبرمج، كذلك تسليط الضوء على التمييز من تكر مستقلة الآثار التي قد تترتب مثبطات في الحث على موت الخلايا. وعلاوة على ذلك، يسمح فحص الخلوي-القائم على التدفق باستخدام قراءات متعددة كعلامات مميزة التنشيط، التي يمكن أن التقرير آثار مثبطات في فروع فردية منفصلة من إشارات تكر. وفي الحالة المعروضة هنا، كانت هناك مثبطات التي أظهرت تثبيط تفاضلية لتفعيل caspase-3 و CD69 upregulation. نظراً لأن بعض المركبات قد تؤثر على وظائف التدبير المنزلي مثل البروتين أو الاتجار حويصلية، ليس من المستغرب لمراقبة آثار على upregulation من حيثياته توليف علامات (مثلاً، CD69) ولكن ليس على بوستترانسلاشونال تعديلات (مثلاً، تفعيل caspase-3 بروتيوليتيك).
المقايسة المقدمة هنا تدابير المبرمج كقراءات، من المحتم أن آثار السمية الكامنة مثبطات لا يحجب النتائج. على سبيل المثال، في الشاشة، ونحن لا تضعف staurosporine تتجاوز 1 نانومتر، على الرغم من كونها لا تزال السامة للخلايا في هذا التركيز. النتائج التمثيلية الاتفاق مع staurosporine كونه مثبط كيناز منحل ومحفِّز للمبرمج33. دون إضعاف المركبات اختبار غير سام بتركيزات كافية، فمن الممكن نتغاضى عن الزيارات المحتملة.
فحص استراتيجية مفصلة هنا سيكون من الصعب أن تطبق على البشر بسبب المضاعفات المرتبطة بالحصول على عدد كاف من الثيموسيه للفرز الفائق. ومع ذلك، من الممكن الحصول على العينات البشرية الغدة الصعترية من خزعات طب القلب34،35 أو من الأجنة36،37. ومع ذلك، كإشارات تكر مسارات وتسلسل الأحماض الأمينية مما يشير إلى البروتينات هي المحافظة إلى حد كبير بين الفئران والبشر، الإنزيم ثيموسيتي يوفر استراتيجية فرز أولية مفيدة، والحصول على أية نتائج مع هذا التحليل باستخدام الماوس يمكن، بعد ذلك، التحقق من نمو في الخلايا الليمفاوية البشرية الأساسية.
واحد الحد من البروتوكول تعتمد على الطرد المركزي التقليدية تتعلق باحتمال فقدان الخلية، التي يمكن أن تعزى إلى طبيعة متعددة الخطوات العملية التي تنطوي على خطوات مثل بيرميبيليزيشن الخلية والطرد المركزي. كل الطرد المركزي واستثارة خطوة لا محالة يؤدي إلى فقدان الخلايا. في حين أن هذه الخسائر قد لا تكون حاسمة بالنسبة للدراسات التي تنطوي على عدد محدود من العينات، يمكن أن تشكل مشاكل عند تطبيقها في الفحص أعلى من الناتج، وبخاصة كما تقدم تنسيق المقايسة من 96-إلى 384-إلى 1536-جيدا. طريقة واحدة للتحايل على هذه المشكلة من خلال استخدام أجهزة الاستشعار caspase نيون نفاذية الخلية38 التي تمكن من الكشف عن تفعيل caspase مع تجنب المضاعفات الناجمة عن بيرميبيليزيشن الخلية ومتعددة يغسل5. بدلاً من ذلك، تستخدم أسلوب الطرد المركزي المستقل لغسل الخلايا بالتدفق الصفحي أيضا الممكنة للتقليل إلى أدنى حد من الخسائر في الخلية. مع صفيحة الآلي الغسيل محطة بالاقتران مع لوحة الجدار أقل، تغسل الخلايا بالتدفق الصفحي دون استخدام أجهزة الطرد المركزي. أسي إضعاف الكواشف يتيح الشطف شامل وفعال للخلايا في أقل من 3 دقائق، الذي يمثل إضعاف ما يعادل مجموعتين من الغسيل الطرد المركزي. دون الخارجية تؤكد سبب الطرد المركزي، الخلايا أكثر قابلية للاستمرار وخلية الخسائر إلى أدنى حد.
ونحن أيضا استكشاف إمكانية استخدام لوحة الآلي الغسيل محطة بعد استزراع الثيموسيه في 96-جيدا U-أسفل اللوحات، وأيضا، استزراع الخلايا مباشرة في لوحات الحائط أقل متوافقة مع لوحة الآلي الغسيل محطة. استزراع الخلايا في لوحات الحائط-أقل ممكناً القضاء على جميع الخطوات الطرد المركزي والتقليل من فقدان الخلية من خلال القضاء على الحاجة إلى نقل عينة عبر لوحات. وبصفة عامة، قابلة للمقارنة في الكفاءة التحفيز وتلطيخ ثلاثة بروتوكولات مختلفة. توفر محطة الغسيل الآلي الاستفادة من الأتمتة، وسرعة وكفاءة، مما يجعل من الأسهل للتحليل ارتفاع الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، مع زيادة التشغيل الآلي، يمكن القيام بالخطوات الغسيل أسرع، وهناك قدر أكبر من اتساق بين تجارب أو المجربون. بيد أن المحطة الغسيل ببعض العوائق: كميات كبيرة من الغسيل المخازن المؤقتة مطلوبة لغسالة فتيلة (150 مل كل تغيير المخزن المؤقت، الذي يستخدم 50 مل للغسيل)؛ يلزم الحذر عند التعامل مع اللوحة لتجنب أي تلوث الصليب من الآبار بسبب تقسيم محدودة بين الآبار للوحة صغيرة الحجم؛ المخزن المؤقت المتبقية من 25 ميليلتر في الآبار بعد الغسيل يتطلب استخدام الكواشف التي أعدت في أعلى من تركيز 1 x. لمعالجة قضايا الحجم المتبقي وقدرة الحجم المحدود اللوحة، يمكن إضافة ملحق لتوسيع حجم حاضنات من ميليلتر 70 إلى 150 ميليلتر، تيسير اعتماد البروتوكولات التقليدية. في حين نظم مناولة لوحة الآلي متاحة حاليا، لديهم بصمة كبيرة بالمقارنة مع نظام الغسيل طبقية، ووحدة صغيرة من ~ 1 قدم مكعب (~0.028 م3). علاوة على ذلك، إدماج الطرد المركزي في لوحة الآلي نظم معالجة صعبة، يحد من استخدامها في الخلية الغسيل. لا يوجد حاليا لا خلية أخرى مستقلة عن أجهزة الطرد المركزي غسل الأدوات المتاحة، وبقدر ما نعلم.
فحص الاستراتيجية المعروضة هنا قادرة على تحديد الجزيئات الصغيرة، وعلى مؤنزم الهدف المزعوم، التي تؤثر على إشارات تكر وتنشيط خلايا تي. المكتبة المستخدمة هنا تتألف أساسا من مؤنزم مثبطات جزيء صغير وقادرة على توليد عدد من يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام مرات. البروتوكول يمكن أيضا سهولة تطبيقها إلى مكتبات مثبط إنزيم الطبقات الأخرى أو إلى أنواع أخرى من الجزيئات الصغيرة، فضلا عن المكتبات من مركبات أخرى (مثلاً، الجزيئات المختلفة). يمكن أيضا استخدام البروتوكول شاشة أخرى أنواع الخلايا، مثل الخلايا اللمفية تي هامشية أو مخلدة الخلايا، بما في ذلك الإعراب عن تكرس المحورة وراثيا أو تنفيذ نظم مراسل. تحديد ووصف وسطاء جديدة من إشارات يمكن تحسين معرفتنا بمسار الإشارات وأيضا المساعدة في تطوير العلاج المستهدفة في مأمن من الأمراض13،،من1415، تي خلية 16-في كل شيء، تضيف هذه الدراسة على مجموعة الخيارات المتاحة للكشف عن الوسطاء من تي خلية إرسال الإشارات عن طريق الفرز الفائق فحوصات.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المجلس الوطني للأبحاث الطبية سنغافورة التابعة لوزارة الصحة ونمرك CBRG15may017 وسنغافورة وزارة التعليم، 2014-T2-1-136 (إلى N.R.J.G.).
Materials
| RPMI | HyClone | SH30027FS | |
| FBS | HyClone | SH3007103 | |
| L-Glutamine | HyClone | SH3003401 | |
| Sodium pyruvate | HyClone | SH3023901 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 516732 | |
| 10X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
| Kinase Screening Library (96-Well) | Cayman Chemical | 10505 | Exact contents of the library may vary |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| anti-CD3/CD28 beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | |
| FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit | BD Pharmingen | 550480 | Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody |
| DA-Cell Washer | CURIOX | HT1000 | |
| 96-well DA-Cell Plate | CURIOX | 96-DC-CL-05 | |
| Antibodies | |||
| CD3e | BioLegend | 100236 | |
| TCRb | BD Biosciences | 553174 | |
| CD4 | BD Biosciences | 740007 | |
| CD8 | BD Biosciences | 563786 | |
| CD69 | eBioscience | 25-0699-42 | |
| Inhibitors | |||
| TG003 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PKC 412 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Doramapimod | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Paclitaxel | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erlotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-5 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-BEZ235 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Phthalazinone pyrazole | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-879 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 1-NA-PP1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Torin 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide II | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIBF 1120 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SMI-4a | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10657 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-703026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Chelerythrine chloride | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Tunicamycin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| GSK 1059615 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Ruxolitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 505124 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| INK128 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Canertinib (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 431542 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 173074 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Valproic Acid (sodium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 0325901 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| VX-702 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Emodin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIO | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Imatinib (mesylate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sunitinib Malate | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Gefitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 3-Methyladenine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide I | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide IV | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide V | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 663284 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D 4476 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NU 7026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-9 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Indirubin-3'-monoxime | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-62 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-93 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CGP 57380 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Iso-Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide VIII (acetate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ST638 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6656 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY364947 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10621 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| YM-201636 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 447439 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-041164 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-AEW541 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP242 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ABT-869 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10622 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 17β-hydroxy Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10626 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6668 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10572 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| N,N-Dimethylsphingosine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY294002 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| U-0126 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Staurosporine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-92 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 (potassium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| O-1918 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 98059 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 169316 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TGX-221 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D-erythro-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| OSU03012 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| JNJ-10198409 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Arachidonic Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lauric Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-252424 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10505 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI-103 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PIK-75 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sphingosine Kinase Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Piceatannol | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (R)-Roscovitine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BAY-43-9006 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10561 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-604850 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI3-Kinase α Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ML-9 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Triciribine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erbstatin Analog | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Kenpaullone | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-494 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-825 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1478 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 216763 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 415286 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-17 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-8 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LFM-A13 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-514 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Apigenin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10554 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| DRB | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-13022 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-14620 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-490 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-82 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-99 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-213 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-183 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lavendustin C | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 336372 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 5-Iodotubercidin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 202190 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10571 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Nilotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SP 600125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| L-threo-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-89 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| HA-1077 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-370 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1296 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KT 5823 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Janex 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10574 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10575 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10576 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NH125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TWS119 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 210902 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10577 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10578 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 184161 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CCT018159 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Myricetin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
Referenzen
- Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
- Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
- Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
- Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
- Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
- Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
- Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
- Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
- Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
- Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
- Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
- Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
- Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
- Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
- Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
- Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
- Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
- Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
- Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
- Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
- Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
- Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
- Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
- Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
- Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. . Novel compounds. , (2003).
- Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
- Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
- Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
- Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
- Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
- Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
- Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
- Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).
Diesen Artikel zitieren
Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).