免疫荧光定量小鼠脑突触蛋白的异种分布

神经元之间的通信发生在称为突触的特殊接触点。突触包含无数不同的蛋白质, 这些蛋白质协调着突触的传递。其中一些蛋白质在整个神经系统中表现出异质分布, 并不是在每个突触1中都存在。这种蛋白质的一个例子是 munc13, 它参与了突触囊泡的启动过程。munc13 有不同的等形, 它们在整个大脑^中分布不均, 而特定等形的存在或不存在会影响短期突触可塑性和突触囊动力学^{3,4 个,5}. 因此, 能够识别大脑各区域存在不同的突触蛋白至关重要。

突触蛋白的定量选择方法–到目前为止–是质谱和西方印迹, 而不是免疫组织^{化学 6,7},^8,9。在某些情况下, 有几种方法相互补充, 以评估特定蛋白质的数量和定位 (即wilhelm等人).¹⁰). 我们在这里描述的方法允许对感兴趣的蛋白质进行定位和定量, 而无需使用任何生化方法, 只需使用免疫荧光污渍。这里的另一个优点是, 量化可以在比其他方法实现的更小的区域上进行, 因此也可以更具体。然而, 人们必须考虑到, 需要一种可靠的参考蛋白质来评估感兴趣的蛋白质的分布。

免疫组织化学的荧光染色使我们能够例行识别蛋白质在大脑区域以及不同神经元隔间内的定位。若要标识不同的隔间, 请使用特定标记。通常情况下, 抗突触素和突触素¹¹的抗体可用于标记突触囊泡, 而针对巴松突的抗体标记突触前^{端子 12}的活动区。水泡转运体, 如水泡谷氨酸转运体 (vglot) 或水泡 gaba 转运体 (vgat), 分别用于标记^兴奋13 和抑制^{性 14}前突触前端子。在突触后, 针对荷马蛋白的抗体可用于标记突触后端子, 而针对突触后密度蛋白 95 (psd95)^15、16、17或 gephyrin¹⁸的抗体可用于标记突触后端子。^,19,20可分别标记兴奋或抑制突触后端子。通过对感兴趣的蛋白质和标记 (如上面描述的) 使用抗体, 可以确定这种蛋白质的定位。迄今为止, 许多研究都以定性的方式做到了这一点。然而, 要可靠地确定特定突触蛋白的差异分布, 不仅必须确定其存在或缺失, 还必须确定其相对浓度。突触的大小和密度的异质性使得建立突触标记和感兴趣的蛋白质之间的比例变得很重要。否则, 突触丰富的区域, 如海马的非锥体层和小脑的分子层, 将显示突触蛋白的高密度, 这只是由于突触的密度较高, 但不是由于该蛋白的强大存在每个突触 (例如, wallrafen 和 dresbach¹)。另一方面, 由于神经元细胞体浓度高, 神经元 soma 中的蛋白质 (例如tgn38 22) 通常会在海马锥体细胞层或海马或小脑颗粒层中显示出强烈的存在在这些地区。因此, 这种结构的非均匀分布, 在这种情况下是突触, 会导致对感兴趣的蛋白质本身的分布的错误估计。此外, 免疫组织化学污渍样品的染色强度存在内在差异。这里描述的协议考虑到了这一点, 避免了这种偏见, 以及免疫组织化学方法引起的其他警告。

在我们最近的研究中, 我们用这种方法来描述 mof (也称为 tprgl²³或 sap30²⁴) 在16个不同大脑区域¹的差异表达。m接管是一种脊椎动物特异性突触蛋白, 可与突触囊泡有关, 并影响神经递质释放^25,26,^27.我们有相关的运动表达突触囊的丰富, 通过染色突触素作为突触囊参考标记。我们发现了高水平的 mof, 特别是在隔膜核, 腹侧苍白, 和杏仁核。在海马区内, 我们发现了一个均匀分布的 mof, 与海马内计算相关的层数较高, 在输入和输出层的水平较低。