التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

يحدث الاتصال بين الخلايا العصبية في مواقع اتصال متخصصة تسمى نقاط الاشتباك العصبي. الاشتباكات العصبية تحتوي على عدد ضخم بروتينات المختلفة التي تنسق انتقال متشابك. بعض من تلك البروتينات تظهر توزيعاً غير متجانسة في جميع أنحاء النظام العصبي وليست موجودة في كل المشبك¹. مثال واحد لهذا بروتين هو Munc13، الذي يشارك في عملية فتيلة من حويصلات متشابك. وهناك isoforms مختلفة من Munc13، التي توزع في جميع أنحاء الدماغ²تقوم، ويمكن أن تؤثر على وجود أو عدم وجود isoforms محددة قصيرة الأجل اللدونة متشابك وحويصله متشابك ديناميات^{3، 4 , 5}-لذلك، أنها ذات أهمية حيوية ليتمكن من تحديد وجود البروتينات متشابك المختلفة عبر مناطق الدماغ.

أساليب اختيار للتحديد الكمي للبروتينات متشابك-حتى الآن-هي الكتلي والغربية النشاف، بدلاً من إيمونوهيستوتشيميستري^6،7،،من⁸⁹. وفي بعض الحالات، يتم استخدام عدة أساليب يكمل كل منهما الآخر لتقييم الكمية وإضفاء الطابع المحلي على البروتينات المحددة (أي، فيلهلم et al. ¹⁰)-الأسلوب يصف لنا هنا يسمح للتعريب والتحديد الكمي للبروتينات للفائدة دون الحاجة إلى استخدام أي أسلوب البيوكيميائية، ببساطة استخدام ستينينجس إيمونوفلوريسسينت. هنا ميزة أخرى هي أنه يمكن أن يتم التحديد الكمي على مناطق أصغر بكثير، ولذلك أكثر تحديداً، من تلك التي تحققت بأساليب أخرى. ومع ذلك، يتعين على المرء أن يأخذ في الاعتبار ضرورة بروتين مرجع موثوق بها لتقييم توزيع بروتين الفائدة.

صبغة الفلورسنت ب immunohistochemistry يسمح لنا بتحديد إضفاء الطابع المحلي على البروتينات بصورة روتينية عبر مناطق الدماغ وكذلك داخل الأقسام العصبية المختلفة. للتعرف على الأقسام المختلفة، يتم استخدام علامات محددة. عادة، يمكن استخدام أجسام مضادة ضد سينابسين وسينابتوفيسين¹¹ لتسمية حويصلات متشابك، بينما الأجسام المضادة ضد عزف تسمية منطقة نشطة من المحطة الطرفية presynaptic¹². الناقلين حويصلية، مثل الناقلين غلوتامات حويصلية (فجلة) أو الناقل غابا حويصلية (فجأت)، تستخدم لتسمية ضادات¹³ و المثبطة¹⁴ محطات presynaptic، على التوالي. من ناحية بوستسينابتيك، يمكن أن تستخدم الأجسام المضادة ضد بروتين هوميروس بمناسبة بوستسينابتيك المحطات الطرفية، والأجسام المضادة ضد الكثافة بوستسينابتيك البروتين 95 (PSD95)^15،،من¹⁶¹⁷ أو جيفيرين^{18 , 19 ,} ويمكن تسمية ²⁰ محطات بوستسينابتيك ضادات أو المثبطة، على التوالي. باستخدام الأجسام المضادة ضد بروتين الفائدة وعلامات مثل تلك المذكورة أعلاه، واحد تحدد إضفاء الطابع المحلي على هذا البروتين. العديد من الدراسات لتاريخ فعلنا ذلك في طريقة نوعية²¹. بيد لتحديد توزيع التفاضلية بروتين متشابك محددة موثوق بها، واحدة يجب أن لا فقط تحديد وجودها أو غياب لكن تركيزه النسبي أيضا. عدم تجانس أحجام وكثافة الاشتباكات العصبية يجعل من المهم إثبات نسبة بين علامة متشابك والبروتين من الفائدة. وبخلاف ذلك، سوف تظهر المناطق الغنية بالمشبك مثل الطبقات غير الهرمية قرن آمون والطبقة الجزيئية المخيخ بكثافة عالية من البروتينات متشابك، فقط بسبب كثافة أعلى من نقاط الاشتباك العصبي ولكن ليس بسبب وجود قوي لهذا البروتين في كل المشبك (مثلاً، والرافين ودريسباتش¹). من ناحية أخرى، البروتينات في سوما العصبية (مثلاً، TGN38²²) سوف تظهر عادة حضور قوي في الخلية الهرمي هيبوكامبال طبقة أو طبقة الخلايا الحبيبية هيبوكامبال أو الدماغ بسبب التركيز العالي للهيئات الخلايا العصبية وفي تلك المناطق. ولذلك، هذا التوزيع غير المتجانس للهياكل، وفي هذه الحالة synapses، يمكن أن يؤدي إلى إجراء تقدير كاذبة لتوزيع البروتين الاهتمام نفسه. وعلاوة على ذلك، يوجد التغيرات جوهرية في تلطيخ كثافات عبر العينات في ستينينجس المناعي. البروتوكول هو موضح هنا يأخذ هذا في الاعتبار، ويتجنب هذه الانحيازات، فضلا عن غيرها من المحاذير التي تنشأ من أساليب المناعي.

في مؤخرا دراسة، وقد استخدمت هذا الأسلوب لوصف التعبير التفاضلية من المحرك (تسمى أيضا تبرجل²³ أو²⁴من SVAP30) عبر مناطق مختلفة من الدماغ 16¹. المحرك هو بروتين متشابك فقاريات محددة يمكن العثور في الرابطة إلى حويصلات متشابك ويؤثر العصبي الإفراج عن^25،،من²⁶²⁷. نحن تتعلق بالتعبير المحرك لوفرة حويصلات متشابك، تلطيخ سينابتوفيسين كعلامة مرجعية حويصلة متشابك. وجدنا مستويات عالية للمحرك خاصة في نواة الحاجز، المكورة البطني وفي اللوزة. ضمن قرن آمون، وجدنا توزيعاً غير متجانسة من المحرك، مع مستويات عالية في الطبقات المرتبطة بعملية حسابية داخل هيبوكامبال، ومستويات منخفضة في طبقات الإدخال والإخراج.