Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique
Summary
Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».
Abstract
Les cellules endothéliales des capillaires du muscle squelettique (cellules endothéliales microvasculaires musculaires, CEMG) mettre en place la barrière entre la circulation sanguine et les muscles squelettiques régissant l’échange de fluides et de nutriments ainsi que la réponse immunitaire contre infectieuses agents en contrôlant la migration des cellules immunitaires. Pour ces fonctions, le CEMG forment une fonctionnelle « myovascular unit » (MVU), avec d’autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les péricytes et les cellules musculaires squelettiques. Par conséquent, un dysfonctionnement du CEMG et, par conséquent, le MVU contribue à une grande variété de myopathies. Cependant, les mécanismes régulateurs du CEMG en santé et la maladie restent insuffisamment compris et leur élucidation précède des traitements plus spécifiques pour les myopathies. L’isolement et une enquête approfondie des principales fonctions de CEMG dans le contexte de la MVU pourraient permettre une meilleure compréhension de ces processus.
Cet article fournit un protocole visant à isoler les primaire CEMG murin du muscle squelettique par dissociation mécanique et enzymatique, y compris la purification et les mesures de maintien de la culture.
Introduction
Via la circulation sanguine, les cellules et les organes sont fournis avec l’oxygène, de substrats et d’autres molécules nécessaires. Cet échange se déroule dans les capillaires, les vaisseaux plus petits. Capillaires forment une couche intérieure de cellules endothéliales (EC) dont l’intégrité est une condition préalable au règlement réussi d’homéostasie musculaire entre l’espace intravasculaire et interstitiel. Afin d’assurer une transition sélective des cellules et des facteurs solubles, EC constituent une monocouche reliés entre eux par serrés et de jonctions adherens 1. Outre son rôle de barrière pour les nutriments ou les produits métaboliques, EC régissent le recrutement des leucocytes dans le processus inflammatoire. Dommages d’inflammation ou d’un tissu conduit à une régulation des molécules d’adhérence sur la surface de l’EC et la production des chimiokines facilitant l’attachement de leucocytes et de la transmigration dans les tissus de cible 2. Par conséquent, EC sont gravement impliqués dans la régulation des processus inflammatoires telles que la défense contre les agents pathogènes ou de la réparation des tissus.
Un dysfonctionnement de l’EC est directement associée à des maladies vasculaires, insuffisance rénale chronique, les infections graves pathogène thrombose veineuse. En outre, EC sont pratiquement toujours impliqués dans certains organes auto-immunité telles que diabète ou une sclérose en plaques 3. La fonction de barrière entre la circulation sanguine et les organes est donc contrôlée par une interaction concertée des différents types de cellules. Dans les muscle squelettique cellules endothéliales microvasculaires (CEMG) ainsi que de cellules musculaires, fibroblastes et péricytes forment une unité fonctionnelle, l’unité « myovascular » (MVU). Par conséquent, un dysfonctionnement de la MVU pourrait jouer un rôle essentiel dans la physiopathologie des myopathies. Toutefois, une meilleure compréhension de ces mécanismes de régulation est toujours porté disparue et s’oppose actuellement à l’identification d’objectifs nouveaux, urgentes, thérapeutiques dans les myopathies.
Afin d’étudier les mécanismes physiologiques et physiopathologiques complexes, des modèles animaux sont couramment utilisés. Cependant, en vitro modèles offrent l’avantage de se concentrer sur le sujet d’intérêt en excluant une variété de facteurs de confusion. Pour étudier les processus in vitro, il est nécessaire d’isoler les cellules primaires pures et viables. Contrairement aux lignées cellulaires, piles isolées d’animaux transgéniques permettent d’enquêter sur les conséquences des modifications génétiques in vitro.
Ici, une méthode pour isoler le CEMG murine primaire est décrite à l’aide de dissociation mécanique et enzymatique suivie magnétique cellulaire activé techniques (MCS) pour la purification de tri. À cette fin, des billes magnétiques contre des marqueurs de surface spécifiques sont utilisés. Plaquettes cellules endothéliales molécule d’adhésion-1 (PECAM1, CD31) est principalement exprimée sur le EC et peut être utilisé pour enrichir ce type de cellule. Pour justifier une pureté élevée de cellules, les cellules d’origine hématopoïétique sont exclues par une sélection négative pour la protéine tyrosine phosphatase du récepteur de type C (PTPRC, CD45). En outre, les contrôles de qualité, culture du primaire CEMG murine, applications potentielles et limitations ainsi que des considérations particulières sont présentés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules endothéliales microvasculaires fournissent des fonctions de barrière dans tous les tissus et leurs résultats de dysfonctionnement dans les maladies des organes connexes 3. En outre, des études spécifiques d’organes de EC microvasculaire pourraient ouvrir la voie pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, une meilleure compréhension de la fonction d’EC microvasculaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est d’un grand intérêt sci…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la « Else Kröner-Fresenius-Stiftung » (2018_A03 tr), « Novateur Medizinische Forschung (FMI) Münster » (I-RU211811 à TR) et fondation de recherche allemande (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 et ME 3283/6-1 à SGM). Illustré d’images fournies par Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Referenzen
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