ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

מידע על מנגנונים אנזים וקינטיקה מתקבלת בדרך כלל על אנסמבל macroscale הרמה או עם אנזים אוכלוסייה באלפים מיליוני מולקולות, כאשר מידות מייצגים ממוצע סטטיסטי. זה ידוע, עם זאת, כי מקרומולקולות מורכבים כמו אנזימים עשוי להדגים הטרוגניות בהתנהגות שלהם, המנגנונים המולקולריים נצפתה רמה אנסמבל אינם בהכרח חוקיים עבור כל מולקולה. כזה סטיות בסולם מולקולה בודדת בהרחבה אושרו על ידי מחקרים של אנזימים יחיד עם מגוון רחב של שיטות המתעוררים במהלך שני העשורים האחרונים¹. ראוי לציין, קרינה פלואורסצנטית גילוי של פעילות אנזים בודדים שימש לחקור הטרוגניות של אנזימים-פעילות-^2,–³ או לגלות את אפקט זיכרון כביכול (תקופות של פעילות אנזימים גבוהה על ידי תקופות של לחץ נמוך פעילות ו ולהיפך)^4,5.

מחקרים אנזים יחיד רבים דורשים כי האנזימים הם ותשמרו על פני השטח או קבוע במרחב בדרך אחרת להישאר מספיק זמן שם שדה הראייה להשגחה מתמדת. אנזים אנקפסולציה בתוך ליפוזומים הוכח להפעלת האנזים הנייח תוך מניעת כל השפעה שלילית בשל פני השטח-אנזים או חלבון אינטראקציות^6,7. בנוסף, ליפוזומים מציעים אפשרות ייחודית ללמוד חלבוני ממברנה אחת שלהם השומנים הטבעיים bilayer הסביבה^8,9,10.

מחלקה של קרום חלבונים, מובילים, תרגילים התקה כיוונית של חומרים על פני קרום התא, התנהגות שניתן רק ללמוד כאשר חלבונים הם מחדש לתוך השומנים bilayers (למשל, ליפוזומים)^{11, 12,13}. לדוגמה, רוברטסונית פרוטון, הוצגו על ידי מספר אנזימים רשתות תחבורה אלקטרון prokaryotic ו האיקריוטים, ממלא תפקיד חשוב בנשימה תאית על ידי יצירת כוח המניע-פרוטון המשמש סינתזת ATP. במקרה זה, פרוטונים שאיבה פעילות זה משולב כדי העברת אלקטרונים, למרות מנגנון מפורט של תהליך זה לעיתים קרובות נותרת חמקמקה.

לאחרונה, להדגים את האפשרות זיהוי פלורסנט זוג עם אלקטרוכימיה ללמוד פרוטון שאיבה פעילות של אנזימים יחיד של מסוף ubiquinol אוקסידאז של Escherichia coli (ציטוכרום בו₃) מחדש ליפוזומים¹⁴. . זה הושג על-ידי ומגעים צבע אטום-ממברנה רגיש pH פלורסנט לתוך לומן של ליפוזומים מקריסטלים של אי coli ליפידים קוטביים (איור 1 א’). כמות חלבון אופטימלי כך רוב ליפוזומים הכיל גם מולקולת אנזים משוקם אין או אחד בלבד (על פי התפלגות פואסון). שני מצעים של ציטוכרום בו₃ נמסרו על-ידי הוספת ubiquinone לתערובת השומנים שיצרו ליפוזומים וחמצן (הסביבה) בתמיסה. ליפוזומים הם מכן בדלילות הספוחה על שקוף למחצה ultra-חלקה זהב אלקטרודה, מכוסה טפט שהורכב עצמית של 6-mercaptohexanol. לבסוף, האלקטרודה נטענה על החלק התחתון של תא spectroelectrochemical פשוטה (איור 1B). שליטה אלקטרוכימי של המדינה quinone בריכת חמצון-חיזור מאפשר אחד בגמישות להפעיל או להפסיק את התגובה אנזימטי בכל רגע, בעוד לצבוע רגיש pH משמשת כדי לעקוב אחר השינויים pH בתוך לומן של ליפוזומים כתוצאה פרוטון רוברטסונית מאת אנזימים. על-ידי שימוש ניתן לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית השני, השומנים מכורך הפלורסנט, גודל ונפח של ליפוזומים בודדים ובכך כימות של אנזים פרוטון שאיבה פעילות. בעזרת טכניקה זו, ובייחוד מצאנו כי ציטוכרום בו₃ מולקולות מסוגלים להיכנס למצב הדליפה ספונטנית כי כלתה במהירות את הכוח המניע של פרוטון. המטרה של מאמר זה היא להציג את הטכניקה של ליפוזום יחיד מדידות בפירוט.