Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo3 als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.
Abstract
Protonen-Pumpen Enzyme des Elektrons übertragen Ketten paar Redoxreaktionen an Protonen-Translokation durch die Membran, erstellen eine Proton-treibende Kraft für die ATP-Produktion verwendet. Der amphiphilen Charakter der Membranproteine erfordert besonderes Augenmerk auf deren Handhabung und Rekonstitution in die natürliche Lipid-Umwelt ist unverzichtbar, wenn Transport Membranverfahren wie Protonen-Translokation zu studieren. Hier zeigen wir eine Methode, die für die Untersuchung des Protonen-Pumpen-Mechanismus der Membran Redox Enzyme verwendet worden ist, Cytochrom Bo3 aus Escherichia coli als Vorbild nehmen. Eine Kombination der Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie dient zur Steuerung der Redox-Status des Quinone Pool und Monitor pH-Wert ändert sich in das Lumen. Durch die räumliche Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie können Hunderte von Liposomen gleichzeitig gemessen werden, während die Enzym-Inhalt auf ein einziges Enzym oder Transporter pro Liposomen verkleinert werden kann. Die jeweiligen einziges Enzym Analyse kann Muster in der Enzym-funktionale Dynamik zeigen, die sonst durch das Verhalten der gesamten Bevölkerung verborgen sein könnte. Wir fügen Sie eine Beschreibung eines Skripts zur automatischen Bildanalyse.
Introduction
Informationen über Enzym Mechanismen und Kinetik ist in der Regel auf das Ensemble oder makroskopischen Ebene mit Enzym Bevölkerung in die Tausende bis Millionen von Molekülen, erhalten wo Messungen einen statistischen Durchschnitt darstellen. Es ist jedoch bekannt, dass komplexe Makromoleküle wie Enzyme Heterogenität in ihrem Verhalten zeigen können und molekulare Mechanismen beobachtet auf der Ensemble-Ebene nicht unbedingt für jedes Molekül gelten. Solche Abweichungen der einzelnen Molekül-Skala wurden weitgehend durch Studien der einzelnen Enzyme mit einer Vielzahl von Methoden, die in den letzten zwei Jahrzehnten1bestätigt. Vor allem, wurde Fluoreszenz-Detektion von einzelnen Enzymaktivität zur Heterogenität der Enzyme Aktivität2,3 zu untersuchen oder entdecken den sogenannten Memory-Effekt (Perioden der hohen Enzyme Tätigkeit ist es gelungen, durch Zeiten der niedrigen Aktivität und umgekehrt)4,5.
Viele einzelne Enzymstudien erfordern, dass die Enzyme auf der Oberfläche oder räumlich feste auf andere Weise ausreichend lange in das Sichtfeld für kontinuierliche Beobachtung bleiben immobilisiert sind. Enzym-Kapselung in Liposomen nachweislich Enzym Immobilisierung und verhindern, dass mögliche negative Auswirkungen aufgrund der Oberfläche-Enzym oder Protein-Protein Interaktionen6,7zu aktivieren. Darüber hinaus bieten die Liposomen eine einzigartige Möglichkeit einzelne Membranproteine in ihrer natürlichen Lipid Bilayer Umwelt8,9,10zu studieren.
Eine Klasse von Membranproteinen, Transporter, übt eine direktionale Translokation von Stoffen über die Zellmembran, ein Verhalten, das nur untersucht werden kann, wenn Proteine in der Lipid Bilayer (z.B. Liposome)11wieder hergestellt werden, 12,13. Zum Beispiel spielt Protonen-Translokation, ausgestellt durch mehrere Enzyme von prokaryotischen und eukaryotischen Elektronentransport Ketten, eine wichtige Rolle in der Zellatmung durch die Schaffung einer Proton-treibende Kraft für die ATP-Synthese verwendet. In diesem Fall ist das Proton Pumpen Aktivität an den Elektronentransfer gekoppelt, obwohl der genaue Mechanismus dieses Prozesses oft schwer fassbar bleibt.
Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, paar Fluoreszenz-Detektion mit Elektrochemie, Proton, die Aktivität der einzelnen Enzyme von der Klemme Ubiquinol-Oxidase von Escherichia coli (Cytochrom Bo3) Pumpen zu studieren die Liposomen14wieder hergestellt. Dies wurde erreicht durch Verkapselung von einer pH-Sensitive Membran undurchlässig Leuchtstofffärbung in das Lumen der Liposome aus E. vorbereitet coli polaren Lipide (Abbildung 1A). Die Protein-Menge wurde optimiert, so dass die meisten Liposomen entweder keinen oder nur einen rekonstituierte Enzym-Molekül (nach Poisson-Verteilung) enthalten. Die beiden Substrate von Cytochrom Bo3 wurden zur Verfügung gestellt, indem Sie die Lipid-Mischung, die die Liposomen und (ambient) Sauerstoff in Lösung gebildet Ubiquinon hinzufügen. Die Liposomen sind dann dünn auf einer halbtransparenten ultrasanfte gold Elektrode, bedeckt mit einer selbst-zusammengebauten monomolekularen Film des 6-Mercaptohexanol adsorbiert. Zu guter Letzt wird die Elektrode an der Unterseite einer einfachen Spectroelectrochemical Zelle (Abbildung 1 b) montiert. Elektrochemische Quinone Pool Redox staatlicher Kontrolle erlaubt es flexibel auslösen oder die enzymatische Reaktion jederzeit zu stoppen, während der pH-Sensitive Farbstoff zur pH-Wert-Änderungen in das Lumen der Liposomen durch Protonen-Translokation durch Überwachung dient der Enzyme. Durch die Verwendung der Fluoreszenzintensität von einem zweiten und Lipid gebundener Fluoreszenzfarbstoff, die Größe und das Volumen der einzelnen Liposomen kann ermittelt werden und somit die Quantifizierung des Enzyms Proton Pumpen Aktivität. Mit dieser Technik fanden wir vor allem, dass Cytochrom Bo3 Moleküle in der Lage sind, einen spontanen Leck Zustand zu schließen, die schnell verflüchtigt sich die Protonen treibende Kraft. Das Ziel dieses Artikels ist es, die Technik der einzelnen Liposomen Messungen im Detail vorstellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebene Methode eignet sich studieren Proton Pumpen durch respiratorische Membranproteine, die in Liposomen wiederhergestellt werden können und sind in der Lage, Elektronen mit dem Quinone Pool austauschen. Protonen-Pumpen-Aktivität kann auf der Single-Enzym-Ebene mit pH-Sensitive (ratiometrischen) Farbstoffe in den Liposomen Lumen (Abbildung 1A) gekapselt überwacht werden.
Die Methode beruht auf der Fähigkeit von Ubichinon (oder andere Quinones), in …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die BBSRC (BB/P005454/1) für die finanzielle Unterstützung. NH wurde durch VILLUM Foundation Young Investigator Programm finanziert.
Materials
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
Referenzen
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. . Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work?. Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA – Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. . Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. . Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
