Um ensaio de clivagem de peptídeo Fluorogenic para triagem de atividade proteolítica: aplicações para coronavirus spike ativação de proteína
Summary
Apresentamos um ensaio de clivagem de peptídeo de fluorogenic que permite uma análise rápida da atividade proteolítica de proteases em peptídeos que representa o local de clivagem de peptídeos de fusão viral. Esse método também pode ser usado em qualquer outro motivo de aminoácido dentro de uma sequência da proteína para testar a atividade da protease.
Abstract
Vírus envelopadas como coronavírus ou gripe vírus requerem clivagem proteolítica de sua proteína de fusão para ser capaz de infectar a célula hospedeira. Muitas vezes o vírus apresentam tropismo celular e tecido e é adaptado a proteases específicas de célula ou tecido. Além disso, estes vírus podem apresentar mutações ou inserções em seu genoma durante a replicação que pode afetar o decote e assim pode contribuir para adaptações para um novo hospedeiro. Aqui, apresentamos um ensaio de clivagem de peptídeo fluorogenic que permite a exibição rápida de peptídeos imitando o local de clivagem de proteínas da fusão viral. A técnica é muito flexível e pode ser usada para investigar a atividade proteolítica de uma protease única em muitos substratos diferentes, e além disso, também permite a exploração da atividade de proteases múltiplos em um ou mais substratos de peptídeo. Neste estudo, nós usamos peptídeos imitando os motivos de sítio de clivagem da proteína coronavirus spike. Nós testamos humana e camelo derivada síndrome respiratória Oriente coronavírus (CoV-MERS) para demonstrar que duplos e substituições no local clivagem podem alterar a atividade de furina e mudar drasticamente a eficiência de clivagem. Também usamos este método em combinação com bioinformática para testar furina atividade de clivagem das proteínas de spike coronavirus felino de diferentes sorotipos e estirpes. Este método baseado em peptídeo é menos trabalho e tempo intensivo do que os métodos convencionais utilizados para a análise da atividade proteolítica de vírus, e os resultados podem ser obtidos dentro de um único dia.
Introduction
Fusão viral com a membrana da célula do hospedeiro é um passo crucial no ciclo de vida do vírus envelopadas e facilita a entrada dentro da célula e a replicação do vírus. Normalmente, os vírus possuem uma proteína especializada (ou proteínas) que se liga aos receptores na membrana da célula do hospedeiro e aciona o vírus-célula membrana fusão1. Proteínas de fusão viral foram agrupadas em três classes principais (I-III)1. Um número de vírus que estão atualmente uma grande preocupação para a saúde pública, tais como o vírus da gripe (representando um longo zoonótico surgimento de aves) e síndrome respiratória Oriente-coronavirus (MERS-CoV) (representando uma recente zoonóticos surgimento de camelos), utilizam os chamados classe I proteínas da fusão, que exigem processamento proteolítica por proteases de acolhimento, para exercer a sua actividade de fusogenic2. Da mesma forma, o coronavírus felinos (FCoV), que representa uma ameaça das principais doenças de gatos selvagens e domésticos, também possuem uma classe proteína da fusão. Classe I fusão viral proteínas normalmente são sintetizadas como um precursor de uncleaved e geralmente consistem em dois domínios que são responsáveis pelo receptor de vinculação e acionando o evento de fusão respectivamente. Até à data, a hemaglutinina de gripe (HA) é o melhor entendida a proteína de fusão e numerosos estudos descreveram seu papel mecanicista na célula entrada e fusão do hospedeiro3. Neste caso a clivagem da proteína de fusão ocorre em uma sequência específica ou local de clivagem dentro HA e em combinação com mudanças conformacionais dependente do pH, os resultados da exposição da fusão viral do peptide1,2.
O peptídeo de fusão e sua sequência de reconhecimento anterior protease são críticos para a patogenicidade e a adaptação do hospedeiro do vírus. Alterações na sequência do reconhecimento de protease podem alterar a clivagem significativamente com consequências potencialmente dramáticas para o vírus e o hospedeiro4. Por um lado, pode revogar a clivagem e, assim, eliminar o ciclo de vida do vírus. Mas por outro lado, uma mutação pode aumentar a especificidade de substrato para uma determinada protease ou permitir que um “nova” protease clivar a proteína de fusão. Posteriormente, este também pode expandir o tropismo celular e tecidos, como observado, por exemplo, com65,os subtipos do vírus da gripe. Geralmente baixo o vírus de patogenicidade (GABP) a gripe aviária e vírus de gripe mais humanos estão confinados ao trato respiratório ou gastrointestinal devido a localização limitada das proteases que ativá-los. Normalmente, o peptídeo de fusão de tais proteínas HA é precedido por uma sequência ácida 4-amino que consiste de 1-2 não-consecutivos aminoácidos básicos, que é reconhecida pela tripsina Serina proteases como tripsina, matriptase ou TMPRSS27, 8. quando o vírus adquire inserções ou mutações que alteram o local de clivagem para um site polibásicos, permite furina para ativar o HA e potencialmente causar um muito mais grave infecção sistêmica6,9. Esses vírus são denominados vírus de gripe aviária de alta patogenicidade (GAAP), caracterizada por cepas H5N1.
Em contraste com gripe HA, coronavírus muitos, tais como MERS-CoV, tem dois sites de clivagem distinta dentro de sua proteína de spike. O site S1/S2 separa o domínio de ligação do receptor de N-terminal (S1) do domínio C-terminal de fusão (S2), com um segundo local de clivagem, chamado S2′, a jusante do site S1/S2, em proximidade com o peptídeo de fusão10. Foi sugerido que os sites são clivados sequencialmente, em seguido por S2 S1/S2 ‘. Em contraste com o HA da maioria das cepas de vírus da gripe, a proteína S MERS-CoV S1/S2 e S2’ sites podem ser reconhecidos por proteases da família proprotein convertase (PC), tais como furina. Membros desta família cleave em resíduos básicos emparelhados com o motivo R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Geralmente, os aminoácidos montante do site clivagem são referidos como P1, P2, P3, etc. contando a partir do local de clivagem e os aminoácidos a jusante são designados como P1′, P2′, P3′, etc. 11. FCoV estirpes ou podem ter um único ou um local de clivagem dual. Como MERS-CoV, algumas cepas de FCoV também possuem dois sítios de clivagem (S1/S2 e S2′) em sua proteína S. No entanto, essa característica é exclusiva de sorotipo eu FCoVs (clado A). Em contraste, membros do sorotipo II (clado B) agrupamento apenas tem um site único clivagem (S2′)2,12. Várias proteases têm sido sugeridos para decompor os locais de clivagem de FCoV, incluindo furina, tripsina proteases e catepsina. Tem sido proposto que a proteína S de FCoV entérica (também conhecida como felina do coronavirus entérico ou FECV) é susceptível de ser clivada por furina no site S1/S2 e mutações neste site (bem como na S2′) leva a mudanças nos requisitos de protease. Estas mutações têm sido associadas com mudanças no tropismo e patogenicidade desses vírus, permitindo que o vírus se tornar sistêmica e macrófago-Trópico (peritonite infecciosa felina também conhecido como vírus ou FIPV)13.
Vírus naturalmente introduzir mutações em seus genomas durante cada ciclo de replicação e frequentemente novos subtipos e cepas de influenza, MERS-CoV e FCoV são descritos14,15,16. Como parte de uma avaliação rápida para avaliar a ameaça de saúde pública de vírus emergentes, é fundamental para investigar mudanças no local de clivagem e como isso afeta o intervalo de proteases ativando estes vírus. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em peptídeo que permite uma avaliação muito rápida de como as mudanças de local de clivagem na proteína S MERS-CoV afetam a especificidade de substrato de uma determinada protease e a tela rapidamente várias proteases por sua capacidade de decompor um determinado ou várias sequências de4. Em um segundo conjunto de experimentos, usamos a técnica para determinar a atividade de clivagem furina mais estirpes e diferentes sorotipos de FCoV.
Os peptídeos utilizados neste ensaio são modificados com o par de transferência (FRET) de energia de ressonância fluorescência, 7-Metoxicumarina-4-yl acetil (MCA) na extremidade N-terminal e N-2,4-dinitrophenyl (DNP) no C-terminal. Durante o ensaio, a MCA é animado e emite energia luminosa que é saciada pela DNP, enquanto o par está nas proximidades, um com o outro. Se clivagem ocorre, no entanto, DNP não é capaz de saciar a emissão mais e ele pode ser lido pelo leitor de placa de fluorescência. As alterações na fluorescência é medida durante o experimento para determinar a taxa de clivagem de peptídeos e para calcular a velocidade na qual a protease cliva o peptídeo específico (também conhecido como Vmax)17.
A fim de projetar os peptídeos, o gene da proteína respectiva fusão deve tenham sido sequenciado e disponibilizado em um banco de dados. No entanto, o método é menos trabalho intenso e dispendioso do que métodos convencionais, que geralmente requerem a clonagem do gene da proteína de fusão em vetores de expressão de expressá-las em células de mamíferos, para analisar a clivagem. Do início ao fim, isto pode demorar vários dias até algumas semanas enquanto os ensaios de peptídeo apresentados aqui podem ser feitos dentro de um dia, assim como peptídeos e proteases estão disponíveis. A instalação do ensaio leva entre 5 e 30 min, dependendo do número de amostras e o tempo de execução no leitor de placa de fluorescência é 1 h. análise dos dados pode levar até 2 h novamente, dependendo do tamanho da amostra.
Aqui, nós escolhemos dois exemplos diferentes para apresentar o ensaio. No primeiro exemplo, apresentamos dados que compara a clivagem mediada por furina dos humanos e camelo-derivado MERS-COVs, para avaliar o potencial das estirpes camelo-derivado de sendo ativado em humanos se cruzam a barreira da espécie. No segundo exemplo, usamos um ensaio de peptídeo fluorogenic para determinar a clivagem furina-mediada da S1/S2 e S2′ sites ou S2′ local de dois sorotipo I e cepas de dois sorotipo II FCoV, respectivamente. Para estas experiências, clivagem de tripsina foi utilizado como controle positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui um ensaio de peptídeo de fluorogenic que permite para uma rápida exibição de sequências de proteínas por sua clivagem proteolítica por proteases. Em nosso primeiro exemplo escolhemos clivagem diferente motivos local da proteína MERS-CoV espiga (S) para ilustrar uma aplicação para este ensaio. Vários envolto de vírus que possuem classe fusão proteínas como MERS-CoV, SARS-CoV (síndrome respiratória aguda grave) e a gripe são grandes preocupações para a saúde pública e novos subtipos estão em constante evolução que tenho um potencial para cruzar espécies barreiras de seus hospedeiros naturais para os seres humanos1,15,16. Isolar os vírus e cultivando-os em laboratório podem não ser sempre viáveis ou requer laboratórios especiais que não estão disponíveis em todas as instalações de pesquisa. Portanto, há uma necessidade de métodos para avaliar a ameaça potencial de saúde pública de vírus emergentes que podem ser conduzidas em condições laboratoriais regulares. Além de vírus visando os humanos, alguns vírus animais como FCoV também possuem a mesma classe I proteínas da fusão, portanto, partilha as características similares do que suas contrapartes humanas. Isolar esses vírus também pode ser um desafio, tornando a utilização de ferramentas inovadoras para estudá-los, se necessário.
Um passo crucial no ciclo de vida dos vírus acima mencionados é a entrada da pilha de anfitrião e fusão mediada pelo processamento proteolítica da proteína respectiva fusão por host proteases1,2. Uma maneira padrão para investigar esta parte do ciclo de vida viral é clonar o gene da proteína de fusão em um vetor de expressão dos mamíferos, transfect células de mamíferos que permitem a expressão da proteína, incubam ou co transfect com a protease de interesse, isolar a proteína e realizar uma análise ocidental do borrão. Este método vem com várias limitações: disponibilidade de DNA/RNA viral para a clonagem, os custos para sintetizar o gene se nenhum DNA ou RNA está disponível, a disponibilidade de um anticorpo para detectar a proteína de fusão e seus produtos de clivagem e pode demorar até vários semanas, até que é realizado o estudo inteiro. Torna-se ainda mais demorado, dinheiro e trabalho intensivo, se o interesse do estudo é investigar várias mutações no site do decote, porque requer mutagenesis local-dirigido. O ensaio de peptídeo fluorogenic que descrevemos aqui não tem essas limitações. Os peptídeos de interesse podem ser projetados com base em sequências publicamente disponíveis, existem vários fornecedores que fornecem uma vasta gama de proteases recombinantes que são relevantes para estes tipos de estudos e o ensaio, incluindo a análise pode ser realizado dentro de um único dia.
No nosso exemplo, nós examinamos mediada por furina clivagem de S2′ local de reconhecimento de protease da proteína S MERS-CoV derivado de seres humanos e camelos do Egito e Marrocos. Tanto o humano EMC/2012 e o camelo HKU205 S2′ sites contêm um motivo de clivagem furina RXXR típico. No entanto, de acordo com a clivagem de PiTou 2.0 marcando o algoritmo HKU205 S2′ local não está previsto para ser clivada por furina, que nós experimentalmente confirmado19. A razão por que HKU5 S2′ não é processado pelo furina pode ser devido a isoleucina no P1′ posição. Quando testamos dois peptídeos que carregava as mutações individuais em S2 o EMC/2012 ‘ sequência, fomos capazes de confirmar que a isoleucina no P1′ largamente revoga clivagem, Considerando que a alanina para substituição de serina resultou no decote reduzido. O Mor213 S2′ local não contiver um motivo de clivagem furina e não foi surpreendente para detectar quase sem clivagem. Também examinamos como furina cliva o S1/S2 e S2′ sites de reconhecimento protease da proteína FCoV S. Fomos capazes de observar furina clivagem de ambos os peptídeos FECV (FECV I e-4 S1/S2 e S2 FECV II 1683’), enquanto o mutantes sequências de vírus FIPV não foram clivadas por furina.
Ao comparar clivagem furina-mediada da EMC/2012 S2′ peptídeo (figura 1A) com os peptídeos FECV I e-4 S1/2 (Figura 2A), descobrimos que havia uma 26-fold diferença aproximada no Vmax. Isso pode ser explicado por motivo de clivagem de furina em ambas as sequências (tabela 1). Enquanto o requisito mínimo para furina clivagem é um motivo RXXR, uma sequência RXRR é muito mais favorável2. Portanto, a EMC/2012 S2′ peptídeo, que tem um motivo RSAR, é clivado com menor especificidade em comparação com o peptídeo FECV I e-4 S1/2 que contém uma RSRR clivagem furina (tabela 1).
No entanto, uma limitação importante do ensaio é que os peptídeos não refletem a estrutura terciária da proteína em que geralmente estão inseridos. Clivagem da proteína de fusão do comprimento total expõe o peptídeo de fusão e gatilhos hospedam a célula de entrada1. A interação entre a proteína protease e fusão também pode ser afetada pela estrutura terciária da proteína de fusão enquanto assumimos que os peptídeos são mais ou menos lineares. Daí, detectada no ensaio de peptídeo de clivagem pode ser artificial e pode não refletir a situação na vivo . Isto foi relatado para a segmentação da gripe H3N2 HA subtipo por matriptase. Enquanto vários grupos descritos clivagem do H3N2 HA por matriptase em ensaios de peptídeo, também foi mostrado que incubação do comprimento total H3N2 HA proteína e matriptase na cultura de pilha não resultou em uma fusogenic HA proteína4,20, 21. Existem outros exemplos que mostram que o Regulamento biologicamente importante da clivagem proteolítica é no nível da conformação da proteína. Tem sido descrito que proteínas da fusão às vezes precisam de uma série de eventos pre-fusão para poderes expor os sítios de clivagem após a fusão. A proteína de fusão de vírus Semliki Forest, por exemplo, requer rearranjos estruturais durante um número de eventos prefusion para expor sua proteína de fusão e torná-lo disponível para ativação proteolítica22. Portanto, os resultados obtidos em um ensaio de peptídeo fluorogenic precisam ser validado pela célula fusão ensaios ou experiências semelhantes. No entanto, o ensaio de peptídeo ainda permite um rastreio rápido de várias combinações de protease/peptídeo e para reduzir o trabalho e o tempo de acompanhamento de experiências, desde que as combinações que não mostram a clivagem são muito prováveis que apresentam o mesmo resultado na vivo.
A segunda grande limitação do ensaio diz respeito as proteases. Até agora só é possível testar proteases solúveis mas não transmembranares proteases. Dependendo da intenção do experimento, isto pode ser um problema. Por exemplo, tem gripe é ativadas por uma série de proteases do transmembrane localizado em membranas celulares8. Em certa medida, este problema pode ser contornado usando os domínios ativos proteolíticas solúveis, mas os resultados têm de ser interpretados com precaução e devem ser validados com métodos convencionais. Nós queremos referir o exemplo referida com matriptase e sua atividade no sentido H3N2 HA. Na vivo matriptase situa-se na membrana celular, mas a enzima comercialmente disponível é o domínio catalítico solúvel. Conforme discutido em relação as proteínas de fusão, é possível que ele também requer a protease completo para interagir com o substrato de proteína completos para obter clivagem e que testes somente domínios único podem resultar em falsos positivos.
Esta metodologia tem demonstrado ser eficiente para estudar a clivagem de sequências específicas de aminoácidos por furina. No entanto, as aplicações de extensões técnica para qualquer protease disponível (por exemplo, cathepsins, proprotein convertase), tornando-se um método útil para candidatos de peptídeo de tela para a segmentação de protease. Além disso, ficou demonstrado que este ensaio também pode ser usado para testar a eficácia dos inibidores de protease e, portanto, fornece uma rápida e fácil de ferramenta a tela proteína inibidores23.
O ensaio de clivagem de peptídeo fluorogenic descrito aqui representa uma adição à clivagem de bioinformatic marcando algoritmos, que prevê a clivagem do péptido por uma protease determinada, com base nas propriedades do ácido aminado e sequência. Estas duas técnicas, em combinação com técnicas de mancha ocidental de tradição podem ser usadas como um método eficiente para estudar protease clivagem em vitro.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento da investigação para o projeto MERS apresentado neste manuscrito foi fornecido pelo NIH grant R21 AI111085. O estudo de coronavirus felino foi apoiado por bolsas de investigação da Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation e do centro de saúde de felino de Cornell. Gostaríamos também de agradecer Malik Peiris para fornecer-nos com Mor213 sequência antes que fosse acessível ao público.
Materials
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
Referenzen
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
- Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
- Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
- Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827 (2017).
- Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
- Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
- Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
- Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
- Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
- Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. , 43-76 (1989).
- Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
- Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
- Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84 (19), 9733-9748 (2010).
- Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic?. Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
- Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
- Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
- Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
- Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
- Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
- Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
- Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
- Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).
