Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Autoradiografia é um método que fornece imagens de decaimento radioativo. A técnica é usada rotineiramente para estudar a distribuição de tecido de uma proteína de interesse em vitro com base em uma interação farmacológica específica entre um composto marcadas com radioisótopos e seu destino. Isto fornece informação directa sobre a seletividade do ligante para o alvo. Em vitro autoradiografia pode também ser utilizada para a determinação quantitativa dos parâmetros de ligação farmacológica de radioligands, tais como a constante de dissociação (K_d) e a densidade dos sítios de ligação (B_máx), bem como para a determinação a constante de inibição (K_i) de concorrentes ligantes^1,2. Comparado aos tradicionais homogenate radioligantes vinculação, autoradiografia tem a vantagem de ser capaz de visualizar a anatomia espacial e dando detalhes sucintas de padrões de expressão regional³. O método de autoradiografia, portanto, é uma alternativa relevante de imunocitoquímica, especialmente na ausência de um anticorpo validado. Autoradiografia é facilmente implementada em um laboratório de radioisótopos padrão dado a disponibilidade de um radioligantes adequado com a necessária especificidade farmacológica, acesso a um criostato micrótomo para a preparação de cortes de tecido e uma imagem adequada dispositivo que é capaz de analisar a distribuição de radioatividade nas seções respectivas tecido. Nomeadamente, um critério importante de seleção para o radioligantes é uma quantidade limitada de ligação a sites não-alvo. Isto pode ser para outras proteínas, membranas ou materiais como plástico ou filtros e é coletivamente conhecido como inespecificas. Geralmente, inespecificas é não saturável, mas podem ser saturável se envolve uma proteína específica de fora do alvo. A melhor forma de validar a verdadeira ligação específica é comparar aos tecidos falta o alvo, por exemplo, geneticamente projetado tecido (nocaute)⁴.

Aqui, a metodologia é ilustrada com a eosina caracterização do sítio de ligação de alta afinidade para ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o cérebro de mamíferos. Compreender a interação farmacológica entre o GHB e o seu sítio de ligação é de relevância como o GHB é uma droga ambos clinicamente útil no tratamento da narcolepsia e alcoolismo⁵, mas, também, um constituinte natural do cérebro de mamíferos e um recreio Droga,⁶. Locais de alta afinidade GHB obrigatórios foram primeiro descritos usando vinculação de GHB [³H] de cérebro de rato homogenate⁷. Ao longo dos anos, mais estudos autoradiografia com [³H] GHB e o análogo [³H] NCS-382 mostrou uma alta densidade de binding sites em regiões prosencéfalo de rato^8,9,10, rato⁹ , cérebro de macaco/humano e¹¹¹²de porco. No entanto, a identidade molecular e a relevância funcional exata desses sites de ligação permaneceram indescritíveis.

Com a intenção de caracterizar ainda mais os sítios de ligação e para facilitar os estudos sobre o papel fisiológico de GHB, foram desenvolvidos vários radioligands, incorporando diferentes isótopos dotados com afinidades diferentes ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA e [¹²⁵eu] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(revisto em¹⁷) (Figura 1). A combinação de radioligands de alta afinidade seletiva e uma densidade muito alta de tecido de binding sites permitiram a produção de imagens de alta qualidade usando o fósforo de imagem técnica^9,11. Juntamente com um resumo dos pontos na criação de uma experiência de eosina e uma ilustração para exemplificar detalhes práticos, a seção de discussão enfatizará i) a escolha do radionuclídeo, ii) a escolha das condições de ensaio e iii) a utilização de fósforo placas de imagem contra a película de raio x. O objetivo geral deste trabalho é fornecer detalhes técnicos, metodológicos e científicos sobre a técnica de autoradiografia para informar sobre a distribuição tecidual e análise farmacológica de alvos de proteína.