Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen
Summary
Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.
Abstract
Neurale Stammzellen (NSCs) multipotent sind und kann die drei wichtigsten Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) entstehen. In-vitro- Kultur und den Ausbau der NSCs bieten eine geeignete Quelle von Zellen für Neurologen, die Funktion von Neuronen zu studieren und Gliazellen zusammen mit ihren Interaktionen. Es gibt verschiedene gemeldeten Techniken für die Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Säugetier-Gehirne. Während der mikrochirurgischen Operation, NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS zu isolieren ist es sehr wichtig, den Schaden zu reduzieren, die Gehirnzellen, das höchste Verhältnis von Live- und erweiterbare Stammzellen zu erhalten. Eine mögliche Technik zum Stressabbau während Isolierung dieser Zellen aus dem Gehirn der Maus-Embryo ist die Reduzierung von OP-Dauer. Hier zeigen wir eine entwickelte Technik für schnelle Isolierung dieser Zellen aus der E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz. Chirurgische Eingriffe sind Ernte E13 -Maus-Embryonen aus der Gebärmutter, schneiden die vordere Fontanelle des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, extrahieren das Gehirn aus dem Schädel, Mikrodissektion von isolierten Gehirn ganglionic Eminenz zu ernten, Dissoziation des geernteten Gewebes im NSC Medium um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewinnen und schließlich Beschichtung Zellen in Suspensionskultur, Neurosphären zu generieren.
Introduction
Neurale Stammzellen (NSCs) befinden sich in verschiedenen Regionen des Gehirns Erwachsener und Embryo und sie haben eine Tendenz, verschiedene Arten von Neuronen und Gliazelle1zu generieren. Die subventricular Zonen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren2 und ganglionic Eminenz im Embryo Gehirn sind NSC reichen Regionen3. In das sich entwickelnde Gehirn liefert die ganglionic Eminenz die meisten kortikale Interneurone und insbesondere GABAergen Interneuronen3. Es gibt auch weniger invasiven Methoden zur Erzeugung von neuronalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen (WSR) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die Senkung der Nachfrage nach Tier verwenden. Trotz der Tatsache, dass die Erzeugung von NSCs aus WSR oder iPSCs möglich4,5ist hat es einige vor- und Nachteile im Vergleich zur Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Gehirn6,7, 8. Die Protokolle zur Induktion der Differenzierung der WSR und iPSCs gegenüber neuronalen Phänotypen sind immer Zeit- und verbrauchen und die Rate der Erfolg (70-80 % Nestin positive Zellen)5 sind niedriger im Vergleich mit direkten Isolierung der NSCs aus dem tierischen Gehirn ( mehr als 99 % Nestin positive Zellen)9. Darüber hinaus verlieren die Stammzellen ihre genetische Stabilität und Differenzierung Tendenz nach mehreren Passagen10,11. Obwohl es andere neue Berichte über die direkte Umwandlung von Körperzellen in NSCs gibt, diese Zellen sind gentechnisch verändert und sind nicht leicht zugänglich in jedem Labor-12. Daher gibt es noch eine große Nachfrage für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus dem tierischen Gehirn; Es ist möglich, die Menge an tierischen Verbrauch zu reduzieren, durch die Verbesserung der Operationstechniken. Durch Reduzierung der OP-Dauer und die Techniken zu verbessern, ist es möglich, halten Zellen weg von Schäden und die höchste Rate an NSCs von jedem Tier zu erhalten.
Hier stellen wir eine vereinfachte und reproduzierbare Technik zur Isolierung von neuronalen Stammzellen von Embryos Gehirn der Maus E13 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit einer geeigneten Bezugsquelle von neuralen Stammzellen ist sehr wichtig für die Neurowissenschaftler. Neurale Stammzellen könnten aus verschiedenen Bereichen des Gehirns Embryo geerntet werden und sie können bestimmte Typen von Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt mehrere Methoden für die Induktion der Differenzierung der neuralen Stammzellen induzieren sie Reifen Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt zahlreiche Berichte, wonach unter bestimmten Kulturbedingungen und trophischen Faktor Regiment…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Royan-Institut unterstützt.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
Referenzen
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neurowissenschaften. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
