Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

L’activation et la prolifération des lymphocytes T sont des étapes cruciales pour le montage des réponses immunitaires réussies. Les progrès récents suggèrent que le métabolisme cellulaire est étroitement liée à la fois le développement et les fonctions des cellules T. Par exemple, les cellules naïves T s’appuient en grande partie sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour répondre à la demande d’énergie au cours de la recirculation parmi les organes lymphoïdes secondaires. Lors de l’activation, naïve T cellules subissent une reprogrammation métaboliques drastiques, y compris l’induction de la glycolyse aérobie pour augmenter la production d’ATP et de remplir les énormes besoins métaboliques au cours de la prolifération et la différenciation cellulaire. Les cellules qui ne parviennent pas à suivre à travers les besoins métaboliques meurent par apoptose^1,2. Au cours de la reprogrammation métabolique, mitochondries jouent un rôle important car ils sont les organites en grande partie responsables de la production d’ATP à fournir de l’énergie pour la cellule, et le contenu des mitochondries cellulaires fluctue au cours de commutateurs métaboliques tout au long de la cellule T développement et activation³. Cependant, l’accumulation des mitochondries superflus ou endommagés peut produire des excès ROS qui endommagent les lipides, les protéines et l’ADN et peut éventuellement conduire à la mort⁴ de cellules

Les mitochondries excessives ou endommagés résultant de modifications métaboliques sont éliminés par une forme spécialisée de l’autophagie⁵, appelée mitophagy. Les mitochondries sont encapsulés par autophagosomes et ensuite fusionnées avec les lysosomes pour dégradation. Ces fermer communications entre les mitochondries et les lysosomes ont généré beaucoup d’intérêt^6,7. Par exemple, le stress oxydant stimule les mitochondries pour former des vésicules dérivés de mitochondries (FDM) qui sont ciblés vers les lysosomes pour dégradation dans une phosphatase et tensine homologue (PTEN)-induite par la kinase putative 1 (PINK1) et parkin (une E3 ubiquitine ligase) ⁸de façon dépendante. On a également constaté que mitophagy est essentiel pour l’adipocyte beige et blanc transition^9,10. Plus important encore, les lysosomes sont pas simplement un compartiment de dégradation, mais aussi un organisme de réglementation de la signalisation cellulaire. L’accumulation excessive de substrat en raison de déficiences enzymatiques entraîne un dysfonctionnement lysosomal en perturbant la perméabilité de la membrane lysosomale et touche Ca^{2 +} l’homéostasie du¹¹. Plus loin, les défauts fonctionnels des lymphocytes T en lipase acide lysosomale (LAL)¹² ou métabolite lysosomal transporteur knockout souris modèle¹³ ont montré l’importance des lysosomes dans le maintien de l’homéostasie des lymphocytes T. Les mitochondries et les lysosomes sont des parties inséparables de la régulation du métabolisme cellulaire. Mesurer le contenu cellulaire mitochondrial a donc été un indicateur crucial pour évaluer l’état de métaboliques et fonctionnel des cellules T.

Tests couramment utilisées pour quantifier cellulaires mitochondriales ou lysosomales des matières incluent immunoblot, microscopie électronique, immunofluorescence (IF) et l’analyse PCR de l’ADN mitochondrial de^14,en numéros de la copie^{15, 16}. immunoblot pouvez comparer quantitativement les taux de protéines à travers différents échantillons et électron ou si la microscopie permet de visualiser les caractéristiques morphologiques de ces organites¹⁷, ces analyses portent certains inconvénients techniques. Par exemple, c’est beaucoup de temps pour acquérir un nombre suffisant d’images de cellule avec fort grossissement et résolution ou pour comparer les niveaux d’expression d’une protéine dans des dizaines d’échantillons, rendant ces dosages considérés comme méthodes de débit faible. En outre, ces tests ne peuvent être appliqués à une population homogène de cellules, telles que des lignées de cellules, mais pas à des échantillons de tissus qui sont composées de peuplements mixtes.

Il est également difficile d’appliquer ces tests auprès de populations rares, pour lesquelles l’exigence d’une cellule minimale des numéros de 10⁶ 10⁸ est impossible à satisfaire. Enfin, les cellules sont habituellement lysés ou fixés au cours du processus, ce qui les rend incompatibles avec d’autres méthodes pour extraire davantage d’informations. Comparaison avec les méthodes traditionnelles, cytométrie en flux axées sur la fluorescence a un débit relativement élevé – l’information de toutes les cellules d’un échantillon composés de populations cellulaires mixtes peut être analysée et recueillie en même temps. En outre, on peut détecter plus de 10 paramètres sur la même cellule et trier les cellules issus des phénotypes désirées pour plus amples essais. Des sondes fluorescentes réactifs ont été utilisés pour étiqueter des lysosomes et des mitochondries dans les cellules vivantes et peuvent être détectées par l’écoulement cytometry^18,19. Ces sondes organite spécifique sont cellulaires perméables et ont des caractéristiques physico-chimiques qui leur permettent d’être concentrée dans des emplacements spécifiques subcellulaires ou organites. Idéalement, ces sondes sont disponibles dans différents formats fluorescents, permettant ainsi à leur demande d’analyse multicolore.

Ce protocole décrit en détail comment combiner le marqueur de surface coloration avec des colorants spécifiques lysosome ou mitochondries lysosomes étiquette ou vivent de mitochondries dans les cellules. Ceci est particulièrement utile pour les échantillons produits des principaux tissus et organes, qui sont souvent composés de populations de cellules hétérogènes. Les chercheurs peuvent identifier des populations de cellules d’intérêt par leur expression du marqueur de surface et mesurer plus précisément le contenu lysosomal ou mitochondrial par l’intermédiaire de colorants organite spécifique dans ces cellules. Ici, nous démontrons la procédure détaillée de cytométrie qui évalue la masse lysosomale ou mitochondriale dans les sous-populations importante des lymphocytes T spléniques.