Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est très condensé et organisée dans des chromosomes. ¹ le premier niveau d’organisation de l’ADN au sein d’un chromosome est l’Assemblée des nucléosomes dans laquelle 147 bp d’ADN est étroitement enroulé autour d’un noyau d’octamère d’histones. ^{2 , 3} particules nucleosome assemblent sur une longue molécule d’ADN formant un tableau de la chromatine qui est ensuite organisé jusqu’à forme une unité très compacte du chromosome. ⁴ le démontage de la chromatine offre l’accès gratuit à l’ADN requis par les processus cellulaires essentielles telles que la réplication du génome et de transcription de gène, ce qui suggère que la chromatine est un système hautement dynamique. ^{5 , 6 , 7} comprendre les propriétés dynamiques de l’ADN à différents niveaux de la chromatine est crucial pour élucider les processus génétiques à l’échelle moléculaire, où les erreurs peuvent conduire à la mort cellulaire ou l’apparition de maladies comme le cancer. ⁸ une propriété de la chromatine de grande importance est la dynamique des nucléosomes. ^{9 , 10 , 11 , 12} la grande stabilité de ces particules a permis la caractérisation structurale de techniques cristallographiques. ² ces quel manque d’études sont déballer les détails dynamiques des nucléosomes tels que le mécanisme de l’ADN du noyau histones ; la voie dynamique qui est requise pour le processus de transcription et de réplication. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} en outre, des protéines spéciales appelées facteurs de remodelage auraient dû être divulgués afin de faciliter le démontage de particules nucléosomique¹⁷; Toutefois, la dynamique intrinsèque des nucléosomes est le facteur déterminant dans ce processus qui contribue au processus de démontage complet. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Techniques de molécules simples comme single-molecule fluorescence^19,20,21, piégeage optique (pincettes)^13,18,22,23 et AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} ont grandement contribué à la compréhension de la dynamique des nucléosomes. Parmi ces méthodes, AFM bénéficie de plusieurs caractéristiques uniques et attrayantes. AFM permet de visualiser et de caractériser les nucléosomes individuels, mais aussi la plus longue de tableaux²⁷. Des images de l’AFM, des caractéristiques importantes de structure nucléosomique tels que la longueur de l’ADN enroulé autour du noyau de l’histone peuvent être mesuré ^10,14,26,28; un paramètre qui est au cœur de la caractérisation de la dynamique unwrapping nucléosome. Passé AFM études ont révélé des nucléosomes systèmes hautement dynamiques et que l’ADN peut spontanément déballer de l’histone base¹⁴. Le déballage spontanée de l’ADN de nucléosomes a été visualisée directement par AFM fonctionnant dans le mode Time-lapse quand l’imagerie est fait dans des solutions aqueuses ^14,26,29.

L’avènement de l’instrumentation d’AFM (HS-AFM) time-lapse à grande vitesse a permis de visualiser le processus de déroulement nucleosome à la milliseconde chronologique ^14,15,24. HS-AFM ^16,30 des études récentes des nucléosomes spécifiques centromère a révélé plusieurs nouvelles caractéristiques des nucléosomes comparées au type canonique. Nucléosomes centromère constituent d’un centromère, une petite partie du chromosome très importante pour le chromosome ségrégation³¹. À la différence des nucléosomes canoniques dans la chromatine en vrac, le noyau histones des nucléosomes centromère contient histone CENP-A au lieu de l’histone H3^32,,³³. À la suite de cette substitution d’histone, habillage de l’ADN dans les nucléosomes centromère est ~ 120 bp au lieu de la 147 ~ bp pour nucléosomes canoniques ; une différence qui peut conduire à des morphologies distinctes des centromères et des nucléosomes canoniques tableaux³⁴, ce qui suggère que la chromatine centromère subit une dynamique plus élevée par rapport à la plus grande partie un. La nouvelle dynamique affichée par nucléosomes centromère dans les études de^{30 16,}HS-AFM exemplifient l’occasion unique fournie par cette technique de molécules simples de visualiser directement les propriétés structurales et dynamiques de nucléosomes. Exemples de ces fonctionnalités seront brièvement examinés et commentés à la fin du livre. Ce progrès ont été réalisés grâce au développement de nouveaux protocoles d’imagerie AFM des nucléosomes ainsi que les modifications des méthodes existantes. Le protocole décrit ici vise à rendre accessible à tous ceux qui voudraient utiliser ces techniques dans leurs enquêtes de chromatine ces avances excitantes études de molécules simples AFM nucléosome. Plusieurs des techniques décrites sont appliquent aux problèmes au-delà de l’étude des nucléosomes et peuvent être utilisés pour les enquêtes sur les autres systèmes d’ADN d’intérêt et de protéine. Quelques exemples de ces applications se trouvent dans les publications^{35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} et les perspectives d’études AFM divers systèmes biomoléculaires sont indiquées dans l’examen des^{29,50,51,53,54}.