Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

En las células eucariotas, el ADN es altamente condensada y organizado en cromosomas. ¹ el primer nivel de organización del ADN en un cromosoma es el conjunto de nucleosomas en que 147 PB de ADN se envuelve firmemente alrededor de un núcleo del octámero de histonas. ^{2 , 3} partículas nucleosoma montan en una larga molécula de ADN formando una matriz de cromatina que luego es organizada hasta que se forma una unidad muy compacta cromosoma. ⁴ el desmontaje de la cromatina proporciona el acceso para liberar ADN requerido por los procesos celulares críticos como gene transcripción genoma replicación y, lo que sugiere que la cromatina es un sistema altamente dinámico. ^{5 , 6 , 7} comprensión de las propiedades dinámicas del ADN en distintos niveles de cromatina es críticamente importante para dilucidar los procesos genéticos a nivel molecular donde los errores pueden conducir a muerte celular o el desarrollo de enfermedades como el cáncer. ⁸ una característica de la cromatina de gran importancia es la dinámica de los nucleosomas. ^{9 , 10 , 11 , 12} la alta estabilidad de estas partículas ha permitido la caracterización estructural mediante técnicas cristalográficas. ² qué falta de estos estudios son los detalles dinámicos de nucleosomas como el mecanismo de ADN desenvolver desde el núcleo de histonas; la vía dinámica que se requiere para los procesos de transcripción y replicación. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} además, proteínas especiales llamadas factores de remodelación se han demostrado para facilitar el desmontaje de partículas nucleosomal¹⁷; sin embargo, la dinámica intrínseca de los nucleosomas es el factor crítico en este proceso que contribuye al proceso de desmontaje todo. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Técnicas de una sola molécula como fluorescencia de una sola molécula^19,20,21, captura óptica (pinzas)^13,18,22,23 y AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} han sido fundamentales en la comprensión de la dinámica de los nucleosomas. Entre estos métodos, el AFM se beneficia de varias características únicas y atractivas. AFM permite visualizar y caracterizar nucleosomas individuales así como los arreglos de discos más²⁷. Imágenes de AFM, características importantes de la estructura del nucleosoma como la longitud del ADN enrollado alrededor del núcleo de histonas pueden ser medido ^10,14,26,28; un parámetro fundamental para la caracterización de la dinámica desenvoltura nucleosoma. Más allá de AFM estudios han revelado los nucleosomas para ser sistemas altamente dinámicos y que espontáneamente puede Desempaquete el ADN desde el núcleo de histonas¹⁴. El desenvolver espontánea del ADN de los nucleosomas fue visualizado directamente por AFM operando en el modo time-lapse cuando la proyección de imagen se realiza en soluciones acuosas ^14,26,29.

La llegada de la alta velocidad instrumentación de AFM (HS-AFM) lapso de tiempo posible visualizar el proceso de desembalaje de nucleosoma en el milisegundo de la escala de tiempo ^14,15,24. HS-AFM ^16,30 los estudios recientes de nucleosomas específicos centrómero revelado varias características novedosas de los nucleosomas en comparación con el tipo canónico. Nucleosomas de centrómero constituyen de un centrómero, una pequeña parte del cromosoma cromosoma segregación³¹críticamente importante. A diferencia de nucleosomas canónicos en cromatina a granel, el núcleo de histonas de nucleosomas centrómero contiene histonas de CENP-A en lugar de la histona H3^32,33. Como resultado de esta sustitución de las histonas, envoltura del ADN en los nucleosomas centrómero es de ~ 120 bp en lugar de los 147 ~ bp de nucleosomas canónicos; una diferencia que puede llevar a distintas morfologías de los centrómero y nucleosomas canónicos matrices³⁴, sugiriendo que la cromatina del centrómero sufre más dinámica en comparación con el bulto uno. La dinámica novedosa de nucleosomas centrómero en estudios de^{30 16,}HS-AFM ejemplifican la oportunidad proporcionada por esta técnica de una sola molécula para visualizar directamente las propiedades estructurales y dinámicas de nucleosomas. Ejemplos de estas características se discuten brevemente e ilustrados al final del documento. Avances debido al desarrollo de nuevos protocolos para la proyección de imagen de AFM de nucleosomas, así como las modificaciones de los métodos existentes. El protocolo aquí descrito pretende hacer accesible a cualquier persona que quisiera utilizar estas técnicas en sus investigaciones de cromatina estos emocionantes avances en estudios de nucleosoma AFM de una sola molécula. Muchas de las técnicas descritas son aplicables a problemas más allá del estudio de los nucleosomas y pueden ser utilizados para investigaciones de otras proteínas y ADN de interés. Algunos ejemplos de este tipo de aplicaciones pueden encontrarse en publicaciones^{35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} y las perspectivas de los estudios AFM de se dan varios sistemas biomoleculares en comentarios^{29,50,51,53,54}.