外显子是新一代的药物输送载体。我们建立了一个具有高产量和纯度的非连续分离协议, 用于 sirna 的传递。我们还将荧光标记的非特异性 sirna 封装到外显子体中, 并研究了癌细胞中含有 sirna 的外显子体的细胞吸收情况。
细胞外囊泡, 特别是外质体, 由于其生物来源、丰度和各种生物分子在细胞间传递的内在能力, 最近成为新的药物传递载体。本工作建立了一个分离方案, 以实现高产量和高纯度的外质体的 sirna 交付。人类胚胎肾细胞 (hek-293 细胞) 在生物反应器瓶中培养, 每周收获培养上清液 (以下简称条件培养基), 以丰富 hek-293 外显子。经调理的培养基 (cm) 通过差动离心预先清除死细胞和细胞碎片, 并在蔗糖垫上进行超离心, 然后再进行洗涤步骤, 以收集外渗。分离的 hek-293 外显子分别通过纳米粒子跟踪分析、蛋白质定量、电子显微镜和流式细胞仪进行了产量、形态和外染色体标记表达的表征。小干扰 rna (sirna), 荧光标记为 atto655, 通过电穿孔加载到外显子中, 通过凝胶过滤去除多余的 sirna。流式细胞仪通过流式细胞仪证实了 panc-1 癌细胞在37°c 孵育24小时后的细胞吸收。hek-293 外显子的直径为107.0±8.2 纳米。外相产率和颗粒蛋白比 (p:p) 分别为 6.99±0.22×10 12 表和 8.3±1.7×10 10 表.sirna 在外质体中的包封效率约为10-20。40% 的细胞在培养后24小时显示 atto655 的积极信号。总之, 超离心分离蔗糖垫提供了良好的产量和纯度的组合。sirna 可以通过电穿孔成功地加载到外显子中, 然后在体外传递到癌细胞中。该协议为开发装有 sirna 的外显子体提供了一个标准程序, 以便有效地传递给癌细胞。
外质体是细胞外囊泡 (ev) 的亚型, 直径从50-200 纳米不等, 由各种细胞类型分泌, 如免疫细胞1,2, 癌细胞3,4,5 ,6和干细胞7。外质体也被证明存在于各种生理液体8,9,10,11。外显子体携带各种生物分子 (如rna 和蛋白质)的内在能力与将这些生物分子有效传递到接受细胞的组合15,16,17. 它们作为纳米药物传递载体的潜力引起了人们的兴趣。各种小分子, 作为抗癌和抗炎药已被证明被成功地加载到外显子体, 并提供给目标细胞18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 有趣的是, sirna28、29和 m微 rna30等核酸也通过电穿孔成功地加载到外显子体中, 并传递给目标细胞。
近年来,通过小干扰 rna (sirna) 进行的 rna 干扰 (rnai) 由于其特异性高、有效、副作用小、易于 sirna 合成28等优点, 成为基因沉默的首选机制, 29岁sirna 是双链 rna 分子, 长度从19到25个核苷酸不等, 触发序列特异性催化 mrna 敲除。由于其分子量大、多阴离子性质, 裸 sirna 被被动吸收到细胞中受到阻碍28,29.由于血浆核酸酶31的快速降解, 赤裸 sirna 也不可能注入全身循环。因此, 将 sirna 封装在纳米载体中, 将有助于将 sirna 有效地传递和吸收到目标细胞中。
外质体是一个理想的系统 sirna 封装, 因为它的结构是由一个中空的, 含水的核心包住了磷脂双层。外质体不仅在血液中具有良好的稳定性, 而且具有自然的靶向特性, 可将功能 rna 传递到细胞32中。alvarez-erviti等人进行的研究成功地证明了使用工程外显子有效地将 sirna 传递到小鼠的大脑, 几乎没有并发症31。据推测, 外显子治疗相对比其他疗法更安全, 因为外显子不会像细胞那样内生复制, 因此不会表现出转移性 15.
据报道, 各种方法可以成功地从细胞培养或生理流体中分离出体细胞。最常用的方法是使用超离心从起始材料31,32,33中颗粒外显子。这种方法可以是相当苛刻的外显子, 通常共同沉淀蛋白质从样本。将超离心与密度为基础的分离 (如蔗糖梯度) 相结合, 变得越来越普遍, 以减少分离外显子 19、34的蛋白质和非外染色体污染。分片排除色谱 (sec) 允许从其他类型的细胞外囊泡 (ev) 的大小分离外质, 也可以导致最小的蛋白质污染, 但受到限制的少量起始材料, 它可以处理35, 36岁免疫亲和力捕获使用与体外表面蛋白 (如四帕辛素或其他细胞特异性标记物) 结合的抗体的珠子, 这些标记允许特定的外显子体捕获, 而不是 ev 或其他蛋白质, 以及分离亚群。外显子从整个样品, 但再次受到起始材料的数量限制, 是昂贵的36,37。聚合物为基础的外显子沉淀也很流行, 但由于它是一个相当粗糙的沉淀, 它导致一个较高的非外质囊泡和蛋白质污染38,39。
电穿孔由于其效率低下的方法, 以加载外显子与 sirna 由于蛋白质聚集15, 28, 31。基于转化的方法具有较好的加载效率和蛋白质稳定性, 但由于其毒性和转染剂在改变细胞基因表达方面的副作用而不受欢迎。因此, 电穿孔在 sirna 加载到外显子中得到了更广泛的应用, 因为它是一种更安全的方法。然而, 需要建立一个优化的封装方法, 以便向目标部位提供足够数量的 sirna, 从而实现有效的基因敲除。
在这里, 我们提出了一个外显子分离协议, 使用密度为基础的超离心, 只在一个 25% (w/w) 蔗糖垫准备在氧化铀, 而不是蔗糖密度梯度。这是一种经济高效的方法, 它可以避免费力的密度梯度制备, 并允许处理大量的起始材料, 但却产生了适合后续使用 sirna 的高产纯度完整的外质体。荧光 atto655 结合非特异性 sirna 通过电穿孔导入人胚胎肾细胞 (hek-293 细胞), 并在体外输送到人胰腺癌 (panc-1) 癌细胞。
从培养的细胞中获得像样的外生细胞产量, 足以进行几轮体外或体内研究, 仍然是一个挑战。据制造商介绍, 生物反应器瓶的目的是生产各种不朽细胞系培养产生高产的抗体和蛋白质。这使得细胞能够不断地用所需的产品丰富培养基, 从而在细胞室中形成一个浓缩的条件培养基 (cm)。从理论上讲, 同样的概念将有利于从不同的细胞系产生外体细胞, 事实上, 在生物反应器瓶中培养这些细胞被证明可以显著提高外生体产量 40。大型中型水库不断向细胞隔间提供营养物质, 并通过 10 kda 半透膜将废物清除出去, 允许长时间培养, 而不需要大量的培养基与细胞接触, 或定期接触烧瓶更换, 最终可以节省大规模外生生产的总成本和劳动力 40。研究还表明, 外显子分离细胞长期生物反应器烧瓶培养的形态、表型以及免疫调节功能与在常规75厘米2烧瓶40中培养的细胞相似。因此, 在生物反应器瓶中培养其他不朽的细胞系作为外生物来源, 将有助于提高其外生细胞产量, 同时保持其完整性和功能。然而, 这种培养形式不适用于分裂周期有限的原代细胞, 也不适用于密度不高的原代细胞。
由于 cm 的收获是每周进行的, 而培养中的细胞从未被传代, 因此可以假定生物反应器瓶中的细胞并不像常规细胞培养那样在单层中生长。它们最有可能形成有坏死中心的星团, 或者只是从表面分离出来, 当细胞对单层来说过于融合时死亡。对生物反应器瓶的细胞室进行目视检查是不可能证实这一假设的, 但在 cm 收获过程中获得的大量死亡细胞反映了这一点。定期从生物反应器瓶中去除粘附不良和不可行的细胞, 可以防止半透膜上的物质积聚, 从而对细胞隔间和培养基之间的气体、营养物质和废物的交换产生不利影响水库, 从而允许长时间培养在生物反应器瓶 & gt;6 月40。在这种背景下, 生物反应器瓶中细胞生长的这种非规律性是理想的, 因为我们推测, 它比传统的单层细胞培养更密切地模仿肿瘤在体内生长的实际情况, 希望外质体生物反应器瓶中的癌细胞所产生的细胞将与体内肿瘤分泌的更相似。这将是特别有益的研究, 研究肿瘤衍生外显子在肿瘤病理进展的作用。据报道, 肿瘤衍生外显子体本质上和优先地回到其起源组织 32, 因此,在一个系统中产生的外显子体模仿它们在体内的生产, 在研究中也是可取的。探索外显子作为药物纳米载体的被动靶向能力。
p:p 比被报道为一个参数, 以评估分离的外显子从污染蛋白质从生理流体培养基中的纯度, 从这些培养基中获得的外质体来自41。本研究得到的 p:p 比为 8.3±1.7×10 pμg, 在本研究中提出的高纯度范围内. 这一比例突出了使用蛋白质浓度来表达在下游研究中分离或使用的外显子的产量或剂量的危险, 因为考虑到蛋白质问题, 这并不能反映样本中可获得的外显子的真实数量隔离过程中的污染。nta通过纳米视觉等仪器, 测量外显子的浓度, 以粒子数, 是一种更合理和准确的方法来量化外显子。
在制备25% 的蔗糖溶液的过程中, 高精度称重至关重要, 因为这种方法是基于密度的隔离。外质体在蔗糖溶液中的浮选密度范围相当狭窄, 因此准确制备蔗糖垫将减少非外质囊泡 (如凋亡体或 golgi-b义囊) 在分离42期间的污染。建议不要保留剩余的蔗糖溶液, 即使在一天后也不要使用, 以避免可能改变其密度的因素的风险, 如通过蒸发或冷凝管道中的空气, 在溶液中增加水。在离心到蔗糖垫上的过程中, 使用摆动转子也是必不可少的, 这样即使外质体从 cm 迁移到蔗糖溶液。
在离心后提取蔗糖溶液也是一个微妙的步骤, 它涉及到在最大限度地减少回收的外显子数量和不要过多地将培养基中的蛋白质引入提取的外显子样本之间找到一个妥协方案.蔗糖溶液和条件介质之间的界面是培养基中的蛋白质收集离心后的情况, 通常可以被看作是位于界面上的深棕色环。在我们手中, 从最初的3毫升添加的蔗糖垫的2毫升是符合上述妥协的最佳体积。本协议中描述的卷适用于所使用的特定转子;因此, 建议在扩大或减少不同设施中可提供的转子类型的体积时, 优化要提取的蔗糖体积。在提取蔗糖时, 避免在管底中心的区域也很重要, 因为这是密度高于蔗糖的颗粒会沉积的地方, 通常可以被看作是一个离白的颗粒。
使用相对较大的 pbs 量的洗涤步骤有助于进一步降低外生体分离过程中的蛋白质污染程度41。这一步骤也是必不可少的, 以消除多余的蔗糖从外质体, 以避免渗透损害外体本身或外膜腔内的生物分子, 以及减少细菌和/或真菌生长在外体细胞股票的风险。在氧化锆而不是水中制备蔗糖溶液有助于减少实现分离所需的蔗糖含量, 从而降低渗透损伤和微生物污染的风险。第一次离心到蔗糖垫上后, 提取并添加到 pbs 中的含蔗糖层可以储存在 4°c, 如果面临时间限制, 第二天就可以进行处理。
据我们所知, 外显子/rna 摩尔比是决定电穿孔效率的重要因素。在这个协议中, 我们使用了1:60 作为 sirna 摩尔比。由于不同类型外显子的封装能力不同, 我们强烈建议在个案基础上对其进行优化。然而, 本文提出的封装效率始终是选择最佳电穿孔条件的参数。
此外, sirna 的聚集被认为是电穿孔中最常见的问题之一。事实证明, 电穿孔可以诱导强的 sirna 聚集, 使其更难进入外显子体。sirna 聚集体通常被错误地解释为将 sirna 封装到外显子体中, 因此在本研究中使用了适当的控制, 因为在电穿孔28过程中,sirna 聚集体的形成是不可避免的。我们的纯化方法的百分比封装效率是通过使用归一化值计算的, 以最大限度地减少其他来源 (如背景噪声、外显子和 sirna 聚合等影响数据可靠性) 的影响。根据我们的发现, 在对照样本中观察到的 sirna 聚集体可以忽略不计,即使用电穿孔和非电穿孔 sirna。
该协议已成功地证明了 sirna 封装到外显子体及其随后的细胞内传递 sirna 到癌细胞在体外。因此, 不同细胞系的各种类型的外显子可以使用拟议的方案进行分离和表征, 然后为不同类型的致癌靶点加载不同类型的致癌靶点。一个有趣的应用将是探索 sirna 的传递和吸收效率使用各种排列体外源-目标细胞对的体外。然后可以将其转化为动物模型, 以评估 sirna 封装的外显子在体内的传递效率和治疗效率.
The authors have nothing to disclose.
f. n. faruqu 由马来西亚政府机构 majlis amanah rakyat (mara) 提供资金。徐先生是 marie sklolowska-curie 个人研究金 (“地平线 2020”) (h2020-msca-if-2016) 的获得者。k. t. al-jamal 感谢 bbsrc (bb/j008656/1) 和 wellcome 信托 (wt103913) 提供的资金。作者还要感谢保罗·拉文德博士和大卫·恐惧博士 (伦敦国王学院呼吸医学和过敏系) 提供了电控剂。
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |