Diagnosi di malattia di Hirschsprung da immunostaining biopsie di aspirazione rettale per calretinina, S100 proteina e proteina gene prodotto 9,5
Summary
Questo protocollo descrive il processo di immunocolorazione delle biopsie di aspirazione rettale per la calretinina, la proteina S100 e il gene proteico prodotto 9,5. Questo nuovo metodo diagnostico adiuvante per la malattia di Hirschsprung ha un tasso di sensibilità e specificità preferibile.
Abstract
La malattia di Hirschsprung (HD) è una malattia intestinale congenita che si manifesta clinicamente come incapacità di passare il meconio nei neonati o come stipsi a lungo termine nei bambini. La biopsia di aspirazione rettale (RSB) per determinare l’assenza di cellule di ganglio e ipertrofia neurale è il test più accurato per la diagnosi di MH al momento. Colorazione ematossilina-eosina tradizionale manca di sensibilità e specificità. La colorazione dell’acetilcolinesterasi non può essere ampiamente utilizzata a causa del suo complesso processo. Il nostro nuovo protocollo di immunocolorazione per calretinina, proteina S100 e proteina genica prodotto 9,5 (PGP 9.5), che abbiamo condotto su rsbs, presenta elevati tassi di sensibilità e specificità di 96,49% (intervallo di confidenza 95%, 0,88-0,99) e 100% (95% di confidenza intervallo di frequenza, 0,97-1,00), rispettivamente. I segmenti affetti da MH spesso presentano l’assenza dell’espressione di calretinina, proteina S100 e PGP 9.5, che sono marcatori di ipertrofia neurale nel tessuto sottomucoso. Questo protocollo descrive il processo operativo dettagliato di questo nuovo metodo diagnostico.
Introduction
La malattia di Hirschsprung (HD) è un disturbo intestinale congenito comune caratterizzato da una mancanza di cellule di ganglio in diversi segmenti del tratto intestinale distale1. Il sistema nervoso enterico umano si forma quando l’invasione delle cellule neurali embrionali è completata. Se c’è un disturbo del processo e l’invasione non riesce a completare, l’intestino distale del neonato diventa aganglionic2. Questa condizione potenzialmente fatale è chiamata malattia di Hirschsprung. La proliferazione, la motilità e la crescita intestinale sono i tre componenti principali della colonizzazione di successo.
La colorazione tradizionale di ematossilina e eosina (H & E) di una biopsia submucosa limitata non può raggiungere risultati soddisfacenti come la colorazione H & E di un tessuto a spessore pieno ottenuto dalla chirurgia. Inoltre, la colorazione dell’acetilcolinesterasi (dolore) del tessuto di aspirazione rettale è teoricamente impegnativa a causa della sua inadeguata sensibilità, che è 91%, e l’elaborazione complessa delle sezioni congelate3,4. Molti altri marcatori immunoistochimici di cellule gangliari e fibre nervose che possono essere macchiati in campioni fissati in formalina e in paraffina stanno gradualmente diventando la diagnostica HD mainstream. La calretinina è una proteina di legame di calcio dipendente dalla vitamina D che non è espressa nel plesso mienterico e submucoso dei segmenti affetti da MH5. La proteina S100 è espressa in cellule derivate dalla cresta neurale, come le fibre nervose e le cellule gliali, che spesso presentano ipertrofia neurale nel tessuto submucoso dei segmenti affetti da MH6. Il gene proteico prodotto 9,5 (PGP 9.5) macchia in modo affidabile le fibre nervose e le cellule del ganglio; La colorazione di PGP 9.5 agisce come complemento alla colorazione del calretinina, specialmente nei casi di ipoanglionosi isolata. La doppia colorazione con S100 e PGP 9.5 può diminuire il tasso di falsi negativi e aumentare la sensibilità. Come prerequisito, lo studio attuale mira a garantire un’adeguata specificità e un’elevata sensibilità di questo nuovo metodo diagnostico. Il nostro nuovo protocollo ha utilizzato tutti e tre i marcatori per la discriminazione dell’intestino aganglionico e delle fibre nervose ipertrofici. Uno studio prospettico di 318 bambini è stato eseguito dal nostro laboratorio e pubblicato in precedenza senza un protocollo dettagliato7. Il protocollo dettagliato e le precauzioni sono discussi in questo articolo. Tutti i neonati che hanno sofferto di un grave problema di defecazione dalla nascita o da bambini affetti da stitichezza cronica, escluse altre malattie comuni, sono potenziali candidati per la biopsia di aspirazione rettale (RSB). Il nostro nuovo protocollo è adatto per la colorazione non solo di RSBs, ma anche di biopsie a pieno spessore o di campioni chirurgici per effettuare una diagnosi finale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto una procedura che utilizza tre diversi anticorpi immunoistochimici per macchiare le sezioni RBS per la diagnosi di MH. La sensibilità del nostro protocollo diagnostico era 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), e la specificità era 100% (95% CI, 0,97-1.00).
Le fasi più critiche del protocollo sono RSB e reazione di antigene-anticorpo. La dimensione della biopsia determina l’accuratezza della colorazione. Una piccola biopsia non fornirà abbastanza tessuto per fare una diagnosi pr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano weibing Tang per il suo grande aiuto nel fornire il laboratorio di riprese. Questo articolo è supportato dalla ricerca sul benessere pubblico, e sono stati ricevuti fondi speciali dalla pianificazione nazionale della salute e della famiglia della Cina (Grant No. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
Referenzen
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
