JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Umwelt

구성 및 다른 환경 조건에서 Bioaerosols의 유통 분석

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58795
, , , , , ,
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

Summary

환경 미 립 자 물질의 생물 학적 구성을 이해 하는 것은 인간의 건강과 질병 확산에 중요 한 영향의 연구에 대 한 중요 하다입니다. 여기, 우리 사용 bioaerosol 샘플링 방법의 세 가지 유형 및 공 수 미생물의 생물 학적 분석 더 나은 다른 환경 조건 하에서 공 수 미생물 지역 사회를 탐구.

Abstract

다른 환경 조건 하에서 미 립 자 물질 (PM)에 가변 미생물 인간의 건강에 중요 한 영향을 있을 수 있습니다. 이 연구에서 우리 설명 하는 프로토콜 환경 오후 5 실험에서 생물학 작곡의 여러 분석 제공 됩니다: 레이저 입자 카운터;를 사용 하 여 (1)는 오후 수 모니터링 (2) 오후 사이 클론 졸 샘플러;를 사용 하 여 컬렉션 (3) 오후 컬렉션 필터; 높은 볼륨에 어 샘플러를 사용 하 여 (4) culturable 미생물 컬렉션 안데르센 6 단계 샘플러; 그리고 세균 16SrDNA 및 곰 팡이 는 지역 시퀀싱 환경 오후의 생물학 구성의 (5) 검출. 우리는이 프로토콜에 응용 프로그램의 두 개의 일반적인 예제로 헷갈리는 일 및 가축 농장을 선택. 이 연구,이 두 가지 샘플링 방법, 사이 클론에 어로 졸 샘플러와 필터 샘플러, 다른 샘플링 효율을 보였다. 사이 클론 졸 샘플러 동안 이러한 두 가지 방법 버섯 수집 동일한 효율성을 보였다 박테리아, 수집 측면에서 훨씬 더 나은 수행 합니다. 사이 클론에 어로 졸 시료 온도 대 한 샘플링 제한 동안 필터 샘플러 낮은 온도 조건에서 일할 수 있습니다. 안데르센 6 단계 샘플러 같은 단단한 영향을 샘플러 culturable 미생물의 생존 율을 증가 하는 문화 매체에 직접 샘플 bioaerosols를 사용할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 주로 의존 문화 동안 미생물의 99% 이상이 경작 될 수 없습니다. 안데르센 6 단계 샘플러와 샘플 수집 culturable 박테리아에서 추출한 DNA 사이 클론 졸 샘플러에 의해 수집 및 필터 샘플러 세균성 16S rDNA 및 곰 팡이 는 지역 시퀀싱에 의해 감지 되었다. 위의 모든 방법 연구, 환경 모니터링 및 공 수 병원 체 검출 등의 많은 분야에서 다양 한 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 이러한 결과에서 우리는 이러한 방법을 다른 조건 하에서 사용 될 수 있습니다 및 다른 연구원은 더 환경 bioaerosols 건강에 미치는 영향을 탐구 도움이 될 수 있습니다 가정할 수 있습니다.

Introduction

자연적인 환경에서 다양 한 종류의 미생물 bioaerosols, 균 류, 박테리아, 바이러스와 다른 미생물1를 포함 하 여 존재 합니다. 가축 농장에서 동물 먹이 작업 등 일부 인간 활동에서 방출 될 수 있다, 공 수 미생물 대기 환경2의 중요 한 내용입니다. 이러한 미생물 뿐만 아니라 대기 환경에 중요 한 역할을 하지만 또한 인류 건강 및 질병 확산에 중요 한 영향을 미칠 수 있습니다.

질병 확산의 중요 한 방법으로 미생물에 어로 졸은 전 세계에 걸쳐 다양 한 관심을 받고 있다. 최근 연구에서 많은 인간 질병 화학 공장, 가축 농장과 smoggy 도시3,4등의 다른 위치에서 환경 미 립 자 물질 (PM)의 복잡 한 구성으로 연결을 발견 했다. 오후의 생물 학적 구성 오후-노출 인간5일부 호흡기 및 심장 혈관 질병에 기여할 수 있습니다. 점 막, 피부, 소화 관, 호흡기, 및 등의 다른 몸 지역 오후6,7에 부착 된 미생물의 잠재적인 대상이 될 수 있습니다. 폐암의 위험이 증가 오후2.58에 장기간된 노출에 의해 발생할 수 있습니다.

공 수 박테리아 퇴 비 시설, tanneries, 우유 처리 시설, 석탄 광산, 지하철 역, 동물 병원, slaughterhouses, 등 세계 여러 나라에서 다양 한 위치에서 조사 되는 치과 클리닉 실내 환경9,10,11,12,13,14,15,,1617, 생성 하 고는 생물학에 어로 졸에 대 한 보고서의 큰 수입니다. 캠퍼스, 가축 농장 연관 붐비는 장소 그리고 헷갈리는 일 동안 대도시 조건은 3 특히 중요 한 공개는 우리 인간의 건강과 오후 노출의 잠재적인 효과 사이의 연결을 탐험 필요. 또한, 중국의 북부 도시에서 겨울 시절, 높은 오후2.5 값 수 있습니다 영향을 인간의 건강. 오후2.5 호흡기 표면 대상으로 독성 효과 생성할 수 있으며 혈액18에 용 해, 그것은 아직 명확 하지 여부와 어떻게 오후2.5 에 부착 된 미생물19 인간의 건강에 영향을 줄 수 있지만 ,20. 가축 농장은 오후의 주요 소스 중 하나 및 공중에 미생물 졸. 병원 균, 인플루엔자 바이러스 등 세라 melitensis, 가축 농장 주변 분야에서에 어로 졸에 의해 수행 하는 많은 노동자 가축 및 가금류에 호흡기 질환을 일으키는 중요 한 요인이 있습니다.

이 연구에서 우리는 여러 유형의 bioaerosols, 오후 번호 모니터링, bioaerosol 수집 및 생물 학적 구성 분석 등의 분석을 탐험. 공기 샘플은 사이 클론 졸 샘플러, 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러와 안데르센 6 단계 샘플러 수집 되었습니다. 그런 다음,이 3 명의 시료에 의해 수집 된 샘플 세균성 16S rDNA 와 자신의 생물학적 구성 결정을 곰 팡이 는 시퀀싱을 포함 한 생물 학적 분석에 의해 분석 되었다. 여기, 우리는 베이징 헷갈리는 일 동안 수집 된 bioaerosol 샘플 및 가축 농장 bioaerosols 인간과 동물 건강에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 나타내는 대표적인 결과 보여줍니다. 액체와 필터 샘플링 방법 비교 했다 주로 16S DNA와 곰 팡이 시퀀싱 데이터에 따라이 연구에서는 또한 탐구 된다.

Protocol

1. 오후 수 모니터링 공 수 레이저 입자를 사용 하 여 총 분 수를 결정 ( 재료의 표참조) 카운터. 공 수 레이저 입자 카운터 상단 공기 샘플링 포트에서 오후를 수집 합니다.참고:이 입자 카운터는 자동화 장비 이며 그것 수 있습니다 독립적으로 작동 때 샘플링 시간, 간격, 컬렉션 시간 등 프로그램, 등 그것의 터치 스크린에 설정 되었습니다. 온도 및 상대 습도 모니터링 하는 센서와 악기를 장비. 측정 하 고 온도 및 상대 습도 데이터 동시에 5 분 마다 기록 합니다. 총, 측정 하 고 기록 6 다른 입자 크기 클래스 (0.3-0.5 μ m, 0.5-0.7 μ m, 0.7-2.5 μ m, 2.5-5 μ m, 5-10 μ m 및 > 10 μ m) 5 분 마다 4 다른 입자 크기 클래스를 측정 하는 동시에 (0.3-0.5 μ m, 0.5-1 μ m, 1-3 μ m 및 ≥ 3 μ m). 샘플러 상단 샘플링 구멍 하지만 공기 샘플을 수집 하 고 각 오후의 입자 크기를 측정 하는 샘플러 내부 테스트 모듈을 사용 하 여. 다음 데이터는 자동으로 저장 됩니다. 위의 모든 프로세스 상대 매개 변수, 시간 샘플링 등 범위를 계산 후 자동으로 수행할 수 있습니다, 그리고 하지만 공 수 레이저 입자 카운터의 미니 터치 디스플레이 설정 됩니다.참고:이 입자 카운터는 자동화 장비 그리고 다른 입자 크기 클래스의 오후의 수를 계산 하는 테스트 모듈. 실험 표준 오차 평가, 다른 입자 크기 클래스 적어도 15 복제와 계산 됩니다 확인 합니다. 판독 악기의 내부 메모리에 저장 되 고 이후 분석을 확인 합니다. 기본 데이터의 분석 포함 각 크기 클래스에서 오후 수 농도, ANOVA 테스트와 오후의 비율을 확인 합니다. 예를 들어 그림 1A에서 같이, 12 월 (237.6 입자/cm3) 오후 번호 농도 했다 10 월에 비해 상당히 높은 (평균: 110.2 입자/c m3) (ANOVA; P-value < 0.05). 그림 1B 보여줍니다 하는 입자의 수는 총 수의 99% 이상을 차지 하는 3 μ m 보다 작은. 레이저 입자 카운터를 사용 하 여 오후 수 농도 모니터링 하 고 자동으로 데이터를 저장. USB 플래시 디스크를 사용 하 여 컴퓨터에서 데이터를 내보내고 ANOVA 테스트 수행. 2. 오후 사이 클론 졸 샘플러 컬렉션 오후 ∼2 m 지상에서 오염 소스 어떤 인근 주요 없이 빈 공간에 샘플링을 수행 합니다. 샘플링 사이트의 위치를 기록 합니다. 예를 들어 베이징 기술 연구소의 캠퍼스는 다음: 39 ° 57’51.0 ‘ N; 116 ° 19’38.5 ‘ E. 사이 클론 졸 샘플러를 사용 하 여 공기 샘플을 수집. 323 L/min, 샘플러 흐름과 6 h의 수집 시간을 사용 합니다.참고: 샘플러 유량 고정 되 고 변경할 수 없습니다. 컬렉션에이 샘플러에만 시작 하 고 중지 버튼으로 수동 시간 유지에 의해 제어 됩니다. 살 균 수를 사용 하 여 컬렉션, 전에 3 번 사이 클론 졸 샘플러의 내부를 세척 하 고 3 번 3 번 지속적으로 수집 버튼을 누르면 자동 청소 기능을 사용. 샘플링을 시작 하 고 중지 샘플링 펌프 버튼을 누르면 수집 버튼을 누릅니다. 장소에 그것을 들고 아무도 샘플러 선반 또는 바닥에 넣어. 이후 분석까지-20 ° C에서 어둠 속에서 모든 샘플을 유지 합니다. 3. 오후 컬렉션 필터 오후 ∼2 m 지상에서 오염 소스 어떤 인근 주요 없이 빈 공간에 샘플링을 수행 합니다. 샘플링 사이트의 위치를 기록 합니다. 예를 들어 베이징 공대의 캠퍼스는 다음과 같습니다: 39 ° 57’51.0 ‘ N; 116 ° 19’38.5 ‘ E. 높은 볼륨에 어 샘플러를 사용 하 여 20.32 × 25.4 cm2 필터 ( 재료의 표참조)에 오후 샘플을 수집 ( 재료의 표참조) 1000 L/분의 유량에서 상대 자동 프로그래밍 하 여 흐름 속도 컬렉션 시간 설정. 이후 분석까지-20 ° C에서 어둠 속에서 모든 샘플된 필터를 유지 합니다. 4. 생물 학적 구성 분석 생물 학적 성분 분석을 위해 샘플 사용 하 여 각 액체 사이 클론 졸 샘플러 또는 필터 샘플에서 multisource DNA 추출 키트에 의해 DNA 추출에 대 한 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 프로토콜에 따라. 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러에서 샘플에 대 한 DNA 추출에 대 한 각 필터 샘플의 1/8을 사용 합니다. 필터를 안쪽으로 향하게 하는 샘플 및 튜브 벽 쪽으로 직면 하 고 다시 50 mL 튜브에 넣어. 10 구슬 샘플을 포함 하는 필터의 측으로 중앙 사이트에 추가 합니다. 실 온에서 15 분 동안 튜브 소용돌이. DNA 추출 과정을 계속 하려면 깨끗 한 50 mL 원심 분리기 관으로 관에 있는 액체 플라스틱. 다음과 같이 프로세스에 의해 샘플에서 DNA를 추출 합니다. 5 분 동안 2000 x g에서 박테리아 샘플을 원심, 상쾌한, 제거 하 고 살 균 PBS 버퍼의 2 mL에 박테리아를 중단. 2 mL 원심 분리기 튜브에서 박테리아의 정지를 수집 하 고 5 분 표면에 뜨는 솔루션 삭제 2000 x g에서 원심. 솔루션에 일시 중단 된 박테리아를 포함 하는 메 마른 PBS 버퍼의 350 μ를 추가 합니다. RNase a.의 0.8 mL을 추가 버퍼 CL의 150 μ와 8 μ K, 성분의 추가 하 고 1 분 동안 흔들어 소용돌이 의해 즉시 혼합. 1000 x g 30에 짧은 원심 분리 후 s (벽에 잔류물), 10 분 동안 56 ° C 물에 원심 튜브를 넣어. 12000 x g에서 버퍼 PD, 그리고 30에 대 한 믹스와 다음 10 분 동안 원심 분리기의 350 μ를 추가 합니다. 2 mL 원심 분리기 튜브에 DNA 준비 튜브를 놓고 준비 관에 단계 4.2.6에서에서 만든 혼합물을 전송 합니다. 12000 x g에서 1 분 동안 원심 다음. 여과 액을 삭제 하 고 다시 넣어 준비 튜브의 내용을 원래 2 mL 원심 분리기 튜브 버퍼 W1의 50 μ를 추가 합니다. 12000 x g에서 1 분 동안 혼합 원심 여과 액을 삭제 하 고 다시 넣어 준비 튜브의 내용을 원래 2 mL 원심 분리기 튜브 버퍼 W2의 700 μ를 추가 합니다. 12000 x g.에 1 분 동안 원심 분리기는 혼합물의 버퍼 W2 700 μ와 다시 세척 하이 단계를 반복 합니다. 폐기물 액체를 삭제 하 고 다시 넣어 준비 튜브의 내용을 원래 2 mL 원심 분리기 튜브. 12000 x g에서 1 분 동안 혼합 원심 DNA 준비 튜브의 내용을 다른 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 넣고 준비 관에서 막의 중간에 추가할 eluent 또는 이온된 수 100 μ (이온을 제거 된 물 또는 eluent가 열 되었다 65 ° c). 1 분 동안 실내 온도에 서 서 혼합물을 허용 하 고 12000 x g에서 1 분 동안 혼합물을 원심. 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (Q-RT-PCR) 박테리아와 샘플링 필터에 곰 팡이의 상대 나타났는데 척도를 수행 합니다. 프라이 머를 사용 하 여 다음과 같습니다: 세균성 16S rDNA, 515F에 대 한 (5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′) 및 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′); 그리고 곰 팡이 , ITS1 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)와 ITS1 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’). 실시간 PCR 시스템에서 Q-RT-PCR 분석 실험을 실행 ( 재료의 표참조). RT-PCR 조건: predegeneration, 95 ° C, 10 분; 변성, 95 ° C, 15 s; anneal 및 확장, 60 ℃, 1 분; 40 사이클 anneal에 변성 및 확장에서. 세균과 곰 팡이 커뮤니티 구조 분석에 대 한 세균의 16S rDNA 의 V1-V3 영역과 PCR에 의해 곰 팡이 rRNA 오 페론의 ITS 영역 증폭. 다음과 같이 뇌관을 사용 하 여: 박테리아, V1-9F (5 ‘-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3) 및 V3-541R (5 ‘-CCA TCT 고양이 CCC TGC GTG TCT CCG 법 CAG-바코드-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3); 그리고 버섯, ITS 3 층 (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3′) 및 ITS-4R (5′-CCA TCT 고양이 CCC TGC GTG TCT CCG 법 CAG-바코드-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’). PCRs의 20 μ 혼합물 포함 2.5 m m dNTPs의 2 μ, 5 × FastPfu 버퍼, 각 뇌관 (5 μ M), FastPfu 중 합 효소의 0.4 μ의 0.8 μ의 4 μ와 10 템플릿 DNA의 ng ( 재료의 표참조). PCR 프로그램을 사용 하 여 다음과 같습니다: 94 ° C 5 분; 30 대 94 ° C의 10 주기 다음 45 55-60 ° C, s, s, 및 72 ° C 90에 대 한 s; 30 대 94 ° C의 20 주기 s, 45 55 ° C s와 90 위한 72 ° C s; 그리고 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장. DNA 정제, DNA 정량화 및 pyrosequencing 이전 연구 21에 설명 된 대로 수행 합니다. 5. Bioaerosol 샘플링 및 재배 국제 표준 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) culturable 공 수 박테리아 및 균 류 사용 35 분의 샘플링 시간 28.3 L/분의 유량에 샘플러의 각 단계에서 문화 접시를 넣어. 각 샘플링 후 75% 에틸 알코올로 샘플러를 충분히 소독.참고: 샘플러 유량은 고정 하 고 수집 시간 수동 시간 유지에 의해 제어 됩니다. 공 수 입자의 공기 역학적 직경에 의해 정의 된 안데르센 6 단계 샘플러와 샘플 6 단계 6 단계를 포함 하 여 (0.65-1.1 μ m), V (1.1-2.1 μ m) 무대, 무대 IV (2.1-3.3 μ m), 단계 III (3.3-4.7 μ m), II (4.7-7.0 µ m) 단계와 단계 I (≥7.0 μ m)입니다. 세균성 입자를 수집 하 고 콩 카 세 인 소화 Agar를 포함 하는 각 단계에서 문화 접시에 입금 ( 재료의 표참조). 샘플러의 각 단계에는 상단에 많은 공기 섭취와 함께 컨테이너가입니다. 24-48 h; 37 ° C에서 공 수 박테리아 컬렉션 판 문화 그런 다음, 각 단계에 대 한 샘플 접시에 박테리아의 식민지 숫자를 계산 합니다. 중복에서 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 수집 된 입자를 방지 하기 위해, 다음 공식에 의해 각 샘플러 수준에서 식민지의 수를 수정:여기서 Pr: 각 수준에서 식민지의 수를 수정N: 모든 수준 (400), 샘플러의 구멍을 샘플링의 번호와r: 식민지의 실제 수입니다. 공기의 m3 당 식민지의 단위를 다음과 같이 계산.여기서 c: 농도 (CFU/m3),N1-N6: 각 수준에서 식민지의 수정된 번호T: 샘플링 시간 (분), 그리고F: 샘플링 흐름 속도 (28.3 L/분)입니다. 단계 5.1-5.3 piggeries의 4 개의 종류를 포함 하 여 가축 농장에서 bioaerosol를 공부 하는 방법을 사용 합니다.참고: 가축 농장은 장 춘, 중국에 위치 해 있습니다. 중앙 위치에서 각 양 지상 2m로 선정 되었습니다 위치를 샘플링.) 박테리아의 문화, 후 단계 6.1-6.2에에서 설명 된 대로 접시에 모든 식민지 취급. 6입니다. Culturable 박테리아의 식별 48 h 또는 경작의 72 h, 후 2 mL 원심 분리기 관으로 박테리아를 놓습니다. Multisource DNA 추출 키트를 사용 하 여 이러한 박테리아 또는 균의 DNA를 추출 ( 재료의 표참조). DNA 추출 과정 섹션 4.2에에서 설명 되어 있습니다. 16S rDNA 시퀀싱에 대 한 200 μ DNA 추출 샘플을 사용 합니다. 단계 4.2, 4.3 및 4.4 생물 학적 구성 분석. 에 설명 된 대로 동일한 프로세스를 사용 하 여

Representative Results

이 연구에서 우리는 수행 전체 오후 분포의 평가 및 낙농 농장에서 bioaerosols의 포괄적인 분석 9 월부터 12 월. 많은 환경 요인에 어로 졸 입자의 분포에 기여 한다. 우리는 TSI 레이저 입자 카운터를 사용 하 여 소 집에서 오후의 농도 및 크기 분포를 공부 했습니다. 그림 1A에서 같이, 12 월에 최고 및 최저 온도 습도 (표 1)의 변화에 의해 발생할 수 있는 10 월에서 연 무질 입자의 농도가 이었다. 흡입 가능에 어로 졸 입자의 농도 (0.3-3.0 µ m) 총 입자 농도 (그림 1B)의 99% 이상을 차지 하 고이 범위에 있는 입자는 깊은 호흡기, 인 간에 대 한 심각한 위험을 일으키는 도달할 수 및 동물입니다. DNA 추출, 세균성 16SrDNA 및 미생물 문화 대신 곰 팡이 는 지역 시퀀싱에 의해 샘플의 생물 학적 구성 분석을 수행할 수 있습니다. Bioaerosol 샘플 필터 사이 클론 졸 샘플러 또는 높은 볼륨에 어 샘플러를 사용 하 여 수집의 생물 학적 분석에서 우리 예비 박테리아와 곰 팡이 수집에서 이러한 두 가지 방법의 효율성을 비교할 수 있습니다. 그림 2 는 2016 년 12 월 20 일 베이징 공대의 캠퍼스에서 베이징 헷갈리는 일 동안 수집 된 bioaerosol 샘플의 분석 결과 보여주었다. 박테리아 컬렉션에 대 한 결과 표시 사이 클론 졸 샘플러 필터 (그림 2A)와 높은 볼륨에 어 샘플러 보다 많은 더 많은 속 수집. 곰 팡이 컬렉션에 대 한 이러한 샘플러 같은 컬렉션 효율성과 속 같은 나타났는데 (그림 2B)에 거의 보였다. 그림 2에 결과에서 박테리아와 곰 팡이 대 한 이러한 두 가지 방법의 다른 수집 효율성을 측정 하기 위해 수 있었습니다. 박테리아 컬렉션에 대 한 사이 클론 졸 샘플러는 샘플 전자에서 보여주었다 (그림 2A) 더 높은 속 풍부 하기 때문에 높은 볼륨 필터 샘플러를 공기 보다 훨씬 더 수행. 그러나, 다른 샘플링 방법에서 두 샘플의 곰 팡이 시퀀싱 분석 거의 동일한 지역 사회 구조 (그림 2B) 보여주었다. 우리는 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 공 수 culturable 박테리아를 공부 했습니다. 그림 3에서 보듯이, 무대-VI 입자에 대 한 culturable 박테리아의 식민지 숫자 감소 되었다. 단계 I 입자 (입자 크기 > 8.2 µ m) culturable 박테리아 식민지의 가장 높은 숫자를 했다. 비율의 단계 I piggeries, 임신 암 퇘 지 집 농기구 등의 4 개의 종류에 있는 식민지, 살 찐 집과 이유 집 33%, 30%, 26% 및 34%, 각각. Piggeries의 4 개의 종류에 있는 단계 II 식민지의 비율이 각각 20%, 22%, 19%와 20% 이었다. Piggeries의 4 개의 종류에 있는 단계 III 식민지의 비율 18%, 18%, 18%와 19%를 각각 했다. Piggeries의 4 개의 종류에서 단계 IV 식민지의 비율이 각각 17%, 16%, 16%, 16% 이었다. Piggeries의 4 개의 종류에서 단계 V 식민지의 비율 10%, 10%, 14%와 6%를 각각 했다. 6 단계 입자 (입자 크기 < 1.0 µ m) culturable 박테리아 식민지의 가장 낮은 번호를 했다. Piggeries의 4 개의 종류에서 단계 6 식민지의 비율 3%, 5%, 6%와 5%, 각각 이었다. 공기 샘플 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 piggeries의 4 개의 종류에서 수집 된 고 적당 한 조건 하에서 경작. 각 입자 단계에서 수집 된 culturable 박테리아의 전체 게놈 DNA 추출 하 고 세균성 16S rDNA 및 곰 팡이 는 지역 시퀀싱에 의해 감지 되었다. 총 91 장군과 158 종의 박테리아는 piggeries에 culturable 박테리아에서 확인 되었다. Piggeries, 집, 임신 농기구 등의 4 개의 종류에서 culturable 박테리아 커뮤니티 구조 뿌리 집, 살 찐 집 이유 집과는 그림 4 에 나와 무대에서 데이터와 내가 6 단계로. 다른 주된 세균 속의 내용을 다른 piggeries 사이에서 동일 하지 않습니다. 그림 1: 4 개의 다른 달에서 오후의 농도 및 크기 분포. (A) Boxplot 연구 기간 동안 오후 수의. 각 boxplot 최대, 최소, 중간, 두 quartiles 및 데이터베이스의 비정상적인 값을 포함합니다. (B) 오후의 평균 크기 분포 지도. 9 월과 12 월 집에서 80 소 했다. 오후의 비율 (≥ 3 µ m) 4 개월에서 (9 월, 10 월, 11 월, 12 월)은 0.005, 0.005, 0.002 0.002 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: 두 명의 시료에 의해 수집 된 bioaerosol 샘플의 생물 학적 분석. (A)와 (B) 다른 수집 방법으로 얻은 bioaerosol 샘플에 세균 이나 곰 팡이 속의 나타났는데 표시. 젖는 벽 공기 샘플러를 사이 클론 졸 샘플러를 나타냅니다. 석 영 필터 필터 하가 볼륨에 어 샘플러를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 평균 piggeries의 4 개의 종류에서 culturable 박테리아의 계층적 분포 지도. Piggeries의 4 개의 종류, 임신 암 퇘 지 집 농기구, 쪄 집 이며 집 이유. S6에 S1 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 수집 된 입자 6 단계를 (나 VI를) 나타냅니다. 단계에서 6 단계를 포함 하 여 공 수 입자의 공기 역학적 직경에 의해 정의 된 (0.65-1.1 µ m), V (1.1-2.1 µ m) 무대, 무대 IV (2.1-3.3 µ m), 단계 III (3.3-4.7 µ m), II (4.7-7.0 µ m) 단계와 단계 I (7.0 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: 세균성 지역 사회 구조와 공기 샘플에서 다른 나타났는데. 공기 샘플 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 piggeries의 4 개의 종류에서 수집 된 고 적당 한 조건 하에서 경작. 각 입자 단계 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 수집 된에 culturable 박테리아의 전체 게놈 DNA 추출 하 고 세균성 16S rDNA 시퀀싱에 의해 감지 되었다. 숫자 1 ~ 6 각 유형의 양 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 VI를 측정 하는 입자 단계를 나타냅니다. 오른쪽에 텍스트 각 박테리아에 대 한 속 이름을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 연구에서 우리는 헷갈리는 일 동안 및 가축 농장에서 가져온 몇 가지 대표적인 결과 제공. 베이징 헷갈리는 일 중 bioaerosol 샘플에서 결과 오후 동안 베이징 헷갈리는 일 없이 오후의 생물 학적 구성의 생물 학적 구성의 더 나은 이해를 촉진. 가축 농장에서 가져온 샘플에서 결과 또한 공기 quality control piggeries 및 이론적 토대와 건강 한 사육에 대 한 기술 지원 및 가축 농장에 안전 생산에 대 한 기본 데이터를 제공 합니다. 온도, 습도, 풍속, 등 많은 환경 요인, 외양 (그림 1)에서 연 무질 입자의 분포에 기여할 수 있습니다. 이전 연구는 가축 농장에서 오후 사료, 배설물, 모피, 깃털, 동물 활동에 관련이 있을 수 있습니다에서 주로 오는 것 밝혀 있다. 환경 요인 동물 활동 뿐만 아니라 집계 및 상대적으로 닫힌된 암소 집에서 오후의 확산에 영향을 수 있습니다. 따라서, 4 개의 다른 달에서 오후의 다른 농도 크기를 감지 우리. 게다가, 위생 상태, 수 유 방법 및 동물 활동 piggeries, 공기 (그림 4)에 culturable 박테리아의 그들의 지역 사회 구조에도 영향을 줄 수 있는 네 가지 유형의 사이 달랐다.

그러나,이 연구에서 우리 주로 우리가 구성과 다른 환경 조건에서 bioaerosols의 분포를 연구 하는 데 사용할 수 사용할 수 있는 방법에 집중. 다른 미생물 샘플에 비해, 공 수 미생물의 매우 낮은 농도 있고 불순물, 수집 및 검색 하는 동안 특정 어려움을 소개 하는 무기 먼지 입자 등의 많은 수로 혼합 이러한 미생물21. 따라서, 미생물에 어로 졸에 대 한 수집 및 탐지의 적절 한 메서드를 선택 합니다. 미생물 졸 샘플 컬렉션은 일반적으로 액체, 반 고체 또는 고체 샘플링 중간22,23,24에에서 미생물을 수집 하는 강수량 메서드 또는 전문된 장비를 사용 하 여 수행 . 그런 다음 몇 가지 해당 기술 치료 및 특정 테스트와 분석 이후에 실행 된다25. 샘플링 매체는 미생물 검출 및 분석26와 관련 된 오류를 줄이기 위해 그대로 유지 해야 합니다. 그러나, 다른 졸 미생물 샘플러 그들의 다른 샘플링 원리와 미디어 샘플의 무결성에 다른 영향을 미칠. 사람들이 다른 샘플링 원리, 관성 impaction, 여과 저항, 정전기 강 수27등을 사용 하는 bioaerosol 샘플의 많은 종류를 디자인 했다.

샘플러 영향을 밀 수 있다 공 수 오후 고속 샘플링 매체로 추출 장비를 사용 하 여. 샘플러 영향의 두 유형이 있다: 고체와 액체. 고체 시료에 영향을 낮은 농도에서 샘플 bioaerosols에 사용 될 수 있고 공기를 거의 안타 수28흐름. 다양 한 크기의에 어로 졸 입자 예비 상영 될 수 있다, 그리고 culturable 미생물10의 생존 율을 증가 하는 문화 매체에 직접 미생물을 샘플링할 수 있다. 관성의 영향으로 인해 미생물 연 무질 입자는 쉽게 동일한 사이트에서 충돌 하 고 식민지 문화 후 쉽게 겹칠 수 있습니다. 현재, 가장 일반적인 고체 영향을 샘플러 안데르센-6 미생물 졸 샘플러가입니다. 이 연구에서 우리는 다양 한 크기의 공 수 오후에 배포 하는 culturable 박테리아 연구 안데르센 6 단계 샘플러를 사용.

사이 클론에 어로 졸 시료 고속 나선형 공기 사이 클론을 사용 하 여 실린더 또는 원뿔에. Bioaerosol 입자는 원심력, 즉 미생물 샘플러의 내부 벽에 충돌 수 있습니다 및 다음 샘플링 버퍼에 의해 수집 된 수에 의해 공기에서 분리 수 있습니다. 이 방법은 편리 하 고 오래 큰 흐름에는 시간을 샘플링 하 고 샘플링 작업에 사용할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 작업이 액체에 의존 하기 때문에 낮은 온도에서 구현할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 사이 클론 졸 샘플러 추출 하 고 분석29물의 작은 볼륨으로 샘플링된 공기에서 공 수 병원 체와 입자를 전송 수 있는 사이 클론 젖는 벽 졸 샘플러가입니다.

필터 샘플러 낮은 온도 조건에서 작업할 수 있으며 특정 크기 이상의 입자를 샘플링할 수 있습니다. 그러나, 그들은 미생물 활동에 큰 영향을가지고 되며, 손상 하는 경향이 크게 활동 샘플링에 대 한 후속 연구를 좌우할 것 이다. 이 연구에서는 베이징 헷갈리는 일에서 bioaerosol 샘플 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러와 사이 클론 졸 샘플러를 사용 하 여 수집 되었다. 이 실험의 목적은 분리 없이 오후의 생물 학적 구성 및 공 수 미생물의 경작을 분석 하는 것 이었다. 따라서,이 두 가지 샘플링 방법이이 연구에 적합 했다. 사이 클론 졸 샘플러 방법에 대 한 낮은 농도에서 공 수 미생물 실행 버퍼에 쉽게 추출 될 수 있다 고 필터 샘플에 대 한 일반적으로 사용 되는 추가적인 처리 없이 편리 하 게 분석할 수 있습니다. 이 연구,이 두 가지 샘플링 방법, 사이 클론에 어로 졸 샘플러와 필터 샘플러, 다른 샘플링 효율을 보였다. 견본을 위해 필터, 필터에서 샘플을 복구 하는 등 일반적으로 사용 되는 추가 치료는 이러한 두 가지 방법 사이의 주요 차이점 중 하나입니다. 게다가, 공기 샘플 수집 했다 실행 버퍼에 직접 클론 졸 샘플러에 의해 다른 방법은 필터에 샘플을 수집 하는 동안. 샘플링 방법의 다른 종류의 특성이 다른 샘플링 효율성에 기여할 수 있습니다. 우리 사이 클론 졸 샘플러는 미생물 컬렉션에 대 한 더 나은 선택이이 가정 추가 확인 필요 가정 수 있습니다.

이 연구에서 세균성 16S rDNA 와 곰 팡이 는 지역 시퀀싱 bioaerosols의 생물 학적 분석을 수행 하기 위해 사용 되었다. 16SrDNA 연속 미생물 게놈30에 16S rDNA 세그먼트의 결정 이다. 16S rDNA 널리 높은 보존 및 미생물 종31의 식별에 유용 하 게 만드는 특이성 원핵생물에 존재 합니다. 전체 게놈 시퀀싱 genomic DNA와 후속 시퀀싱의 추출을만 필요합니다. 많은 양의 데이터를 생성 하는 것 외에도이 과정은 또한 미생물 지역 사회 구조에 대 한 보다 포괄적인 분석에 대 한 수 있습니다. 게다가, metagenomics 또한 사용할 수 있습니다 연구의이 분야에서 미래에 더 많은 정보를 제공 하 여. Handelsman 외. 먼저 미생물 토양32에 1998 종이에 metagenome의 개념을 제안 했다. 후속 연구는 metagenome의 개념은 점차적으로 허용 하 고, 그리고 많은 연구는 인간의 직감, 바다와 토양33,,3435에 포함 된 미생물에 실시 되었다. 높은 처리량 시퀀싱의 지원으로 기술에 metagenomics 빠르게 개발 하 고 병원 체 탐지의 연구에 점점 중요 한 역할을 재생 합니다. 전통 미생물 연구 방법 분리 및 정화에 대 한 문화에 주로 의존합니다. 그러나, 많은 연구 수 없습니다 수행할 수 있기 때문에 미생물의 99% 이상이 경작 될 수 없습니다. 전통적인 방법, 달리 metagenomics 개별 유기 체36를 분리 하는 필요 없이 전체로 서 환경에서 모든 미생물의 유전 정보를 걸릴 수 있습니다. 결과 모든 미생물에 대 한 포괄적인 분석을 직접 수행할 수 있습니다.

요약 하자면,이 학문은 보여주었다 여러 검색, 샘플링 및 분석 방법 연구 환경 오후, 오후 모니터링;를 포함 하 여의 생물 학적 구성에 사용할 수 있는 오후는 안데르센 6 단계 샘플러, 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러 또는 사이 클론 졸 샘플러; 샘플링 그리고 DNA 시퀀싱에 따라 이후 생물 학적 분석입니다. 실제로, 많은 유형의 가축 농장 등 다른 환경 조건 하에서 이러한 메서드를 사용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜 및 결과 추가 환경에서 곰 팡이 및 세균 bioaerosols 건강에 미치는 영향을 탐구 하는 전세계 다른 연구자를 도울 수 있다.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구에 대 한 재정 지원 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 41775148)에서 왔다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

Materials

airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations–a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
  2. Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
  3. Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
  4. Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
  5. Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
  6. Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
  7. Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
  8. Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
  9. Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
  10. Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
  11. Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
  12. Wery, N. Bioaerosols from composting facilities–a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
  13. Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
  14. Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
  15. Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
  16. Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
  17. Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
  18. Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing’s PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
  19. Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
  20. Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
  21. Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
  22. Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
  23. Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
  24. Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
  25. Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
  26. Lednicky, J., et al. . Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
  27. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
  28. Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
  29. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
  30. Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
  31. Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
  32. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
  33. Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
  34. Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
  35. Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
  36. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).

Tags

BioaerosolEnvironmental Particulate MatterAirborne Pathogen DetectionAirborne Laser Particle CounterCyclonic Aerosol SamplerHigh Volume Air SamplerBiological Composition Analysis16S Recombinant DNAITS RegionFungal Recombinant RNA OperonPolymerase Chain ReactionCulturable Airborne BacteriaCulturable Airborne FungiAndersen Six-stage Sampler

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image